[发明专利]外源基因定点整合的双重荧光筛选方法

说明书

本发明涉及基因转移研究领域，是一种转植基因定点整合细胞或胚胎的筛选方法。

基因转移技术用于基因表达、基因功能、物种改良和生物反应器研究。外源基因在受体细胞中，以随机方式整合到细胞基因组中，在此情形下，转植基因难以实现有效表达；另一方面，转植基因的随机插入可能破坏受体基因组的正常功能(Palmiter，R.etal，1982，Nature 300：611-615；朱作言等，转基因鱼模型的建立，1989，中国科学，B(2)：147-155)。利用DNA分子间的同源重组，可以实现转植基因在受体基因组中的定点整合。在动物细胞中，转植基因定点整合效率极低，因此，建立有效的筛选方法至关重要。在小鼠的定点整合研究中，建立了正向选择和正负选择的药物抗性筛选方法(Mansour，S.et al，1988，Nature 336：348-352)，小鼠定点整合在胚胎干细胞中操作，基于胚胎干细胞的发育全能性，通过胚胎嵌合体途径获得定点整合的转基因小鼠，然而，其它动物中尚无完善的胚胎干细胞系统，这一方法在转基因动物研究中的应用受到极大的限制。

本发明的目的是提供了一种外源基因定点整合的双重荧光筛选方法，在转基因细胞中进行荧光筛选获得定点整合转基因细胞；在转基因胚胎中筛选定点整合的转基因动物嵌合体，不需要胚胎干细胞和胚胎嵌合体操作。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：基于正向选择和正负选择原理，构建双重荧光筛选定点整合载体，其步骤是：A、以受体基因中靶位DNA顺序为定点整合载体的同源DNA片段；B、绿色荧光蛋白(EFP)基因为正向选择基因，置于同源DNA片段内；C、蓝色荧光蛋白(BFP)基因为负向选择基因，置于同源DNA片段外侧。再经限制性内切酶消化，得到线性重组DNA片段，电脉冲和显微注射方法将DNA分别导入培养细胞和受精卵中。在转植基因随机整合的细胞中，将可同时观察到绿色荧光和蓝色荧光；在定点整合的细胞中，由于置于同源DNA片段外侧的蓝色荧光蛋白基因在DNA分子同源且过程中被切除，只能观察到绿色荧光。应用流式细胞仪，分选仅出现绿色荧光转植基因定点整合细胞；在荧光解剖镜下筛选仅出现绿色荧光的转基因胚胎，即可获得外源基因定点整合的转基因嵌合体。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明提供了一种有效的外源基因定点整合的检测筛选方法，该方法易行，操作简便。线性DNA分子可有效的导入培养细胞中，48小时后可观察到选择基因的表达，采用流式细胞仪进行双重荧光筛选，可分选出仅出现绿色荧光的定点整合转基因细胞，定点整合效率为1/10⁵；线性DNA分子直接导入受精卵中，在胚胎发育过程中，部分转基因胚胎在荧光解剖镜下可观察到仅出现绿色荧光的定点整合转基因细胞团，由此筛选出外源基因定点整合的转基因嵌合体，定点整合的转基因嵌合体出现频率为1％。

图1为外源基因定点整合载体和双重荧光筛选图。EFP为绿色荧光蛋白基因，BFP为蓝色荧光蛋白基因，NotI为线性化酶切位点。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述：

根据图1可知，其步骤如下：

1、定点整合载体构建

受体基因组中靶位DNA顺序1克隆自鲤鱼和海鲤β-肌动蛋白基因编码顺序及其3′侧翼顺序，β-肌动蛋白基因编码顺序至翻译终止码共1kb为同源短臂2，3′侧翼顺序6kb为同源长臂3；GFP基因4作为正向选择基因，置两同源臂之间；BFP基因5作为负向选择基因，置同源长臂3外侧，定点整合构建体质粒骨架为pBluescript SK(+)6。正向检测引物7设在基因组非靶位DNA顺序8上，反向检测引物9设在载体上。NotI消化，线性DNA用于基因转移。

2、培养细胞基因转移

采用电脉冲方法(Bio-Rad Gene Pulse II)，进行基因转移，电脉冲转移参数；细胞密度10⁷/ml，缓冲液PBS，DNA浓度50μg/ml，电场强度0.8kv/cm，电容25μF，电阻200Ω。

3、受精卵基因转移

鲤鱼或海鲤受精卵用胰蛋白酶消化去卵膜，采用显微注射方法，在第一次卵裂前将DNA溶液导入受精卵动物极，DNA剂量5×10⁵拷贝/每卵，转基因受精卵在实验室无菌环境中孵化。

4、荧光观察和定点整合转基因细胞及转基因胚胎筛选