[发明专利]壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备

说明书

发明涉及生物技术领域，尤其涉及壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备。

甲壳素又名甲壳质、几丁质，学名为聚-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-β-1，4-葡萄糖。甲壳素在自然界中资源十分丰富，主要来源于节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及真菌等生物体中，每年在地球上的自然生成量就达数十亿吨之多。壳聚糖又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素，学名为聚-2-氨基-2-脱氧-D-β-1，4-葡萄糖，它是甲壳素中最重要的衍生物。近年来，壳聚糖作为固定化载体的研究引起了很多学者的重视。由于壳聚糖分子中的氨基对各种蛋白质的亲和力非常高，可以有效地应用于酶的固定化技术中。但若以天然壳聚糖为载体固定化酶，其主要缺陷是：在偏酸条件下发生溶解，使固定化酶难以回收，其中大部分为粉末状，载体流速差，表面积小，限制其应用，特别是在反应器中的应用。因此目前的国内外研究主要集中在制备壳聚糖微球作为固定化酶载体，该载体具有性能优良：具有耐酸耐碱性能好、吸附性能较强、单分散窄分布微球状等特性，从而克服了上述缺陷，是酶固定化的良好载体。木瓜蛋白酶(Papain，EC 3.4.22.2)是一种巯基蛋白酶，是由木瓜乳经提炼而得的一类蛋白水解酶，被广泛应用于防止啤酒冷浑浊、肉类的嫩化、糕点的膨化剂、羊毛的防缩、蛋白质水解产物的制备、牙膏、冷霜及洗涤剂等日化工业及辅助消化药物等。为了提高木瓜蛋白酶的使用效率，降低生产成本，国内外研究人员对木瓜蛋白酶的固定化进行了很多研究，建立了许多固定化方法。但研究主要集中在以尼龙、甘蔗渣纤维素、甲壳素或壳聚糖等作为酶固定化载体，采用吸附法或交联法固定化木瓜蛋白酶，由于载体形状的不规则性、固定化酶的活力回收率普遍较低(36％～51％)及固定化酶对底物的亲和力低等不足之处限制了固定化木瓜蛋白酶的应用。以壳聚糖微球为固定化酶载体，用吸附-交联法固定木瓜蛋白酶未见有报道。

本发明的目的在于进一步开发利用壳聚糖的应用价值、拓宽壳聚糖微球这一优良的酶固定化载体的应用潜力、提高木瓜蛋白酶的使用效率、降低固定化木瓜蛋白酶的生产成本、提高木瓜蛋白酶的应用价值及提供一类新型的固定化木瓜蛋白酶，即壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶。

本发明以壳聚糖为原料，用醋酸溶液将壳聚糖完全溶解得壳聚糖酸性溶胶，壳聚糖与醋酸溶液的比例是2～5∶45～100(重量与体积比)，然后在搅拌条件下将壳聚糖酸性溶胶滴入分散介质透平油中，壳聚糖酸性溶胶与透平油的体积比为1∶2～5，待溶胶均匀分散后，滴入不低于25％的戊二醛溶液，壳聚糖酸性溶胶与25％的戊二醛溶液的体积比是20～30∶1，搅拌10～20分钟后，再用NaOH溶液将其pH调至9～10，于60～70℃水浴保温3～5小时，静置冷却后，弃去上层油层，在下层的固形物中先加入石油醚(I)与多余的透平油互溶，又弃去上层，然后在下层固形物中加入丙酮与剩下的透平油互溶，再弃去上层，然后用无水乙醇抽洗固形物至透平油完全洗净，真空干燥、过60～100目筛，用蒸馏水抽洗除去石油醚(I)、丙酮及无水乙醇，并真空干燥，即得到固定化酶的载体一壳聚糖微球。接着将壳聚糖微球在pH7.2的磷酸缓冲液中浸泡12～24小时，抽干。将抽干后的壳聚糖微球加入浓度为1～2.5mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中，壳聚糖微球与木瓜蛋白酶溶液的比例是0.5～1∶0.6～2(重量与体积比)，于4～40℃吸附4～24小时后，加入0.3～1.5％的戊二醛溶液，使戊二醛溶液与总溶液的最终体积比为0.2～1.0∶100，于4～40℃交联1～5小时，再用pH7.2的磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛溶液并吸干，即制得壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶。