[发明专利]冻干的甲肝疫苗制造工艺

说明书

本发明是一种甲肝疫苗原液的处理技术，用以制造冻干的甲型肝炎减毒活疫苗。

甲型肝炎病毒是小RNA肠道病毒，由它感染引起的甲型肝炎是世界性传染病，能引发大范围流行，威胁人们的健康。目前控制流行的有效措施在于使用疫苗。

1986年美国MERCK公司provost等人获得甲肝病毒F＇减毒株，我国从80年代初开始，用人工诱导方法减毒，选育出疫苗株，其中以L-A-1株和H₂株作为毒种制造的甲型肝炎减毒活疫苗于1992年获试生产文号，已生产了上千万人份疫苗，经大量人群接种观察证明该疫苗安全，有效。

国产的甲型肝炎减毒活疫苗是以人胚肺二倍体细胞为甲肝病毒繁殖基质，接种毒种，在32-36℃条件下培育3-4周，之后收获感染的细胞，并经冻融，超声波处理，通过各项检定即为疫苗成品。这种液体剂型的活疫苗不稳定效期短，需冷链运输与保存。在中国，尤其是在广大偏远农村地区接种，长途运输成本高，增加了人们负担。另外，疫苗效期短易造成制品过期浪费。因此，如果将甲肝疫苗制成冻干剂型，就会延长效期，解决冷链运输的问题。

早在1998年，国内生产厂家就开始着手研制冻干苗，技术上的难点在于以人胚肺二倍体细胞作为甲肝病毒繁殖基质培养制造的活疫苗，直接加入冻干保护剂进行冻干，制品的水份升华受阻，不易成型，达不到保护病毒的目的。

本发明提供的原液处理技术，实现的冻干成型，能有效地保护病毒抗原。

技术方案是在收获的疫苗原液中加入三氯甲烷，振摇使之充分溶解，经超滤洗涤，收集制成病毒悬液，加入保护剂，同时添加微量三氯甲烷，灌装西林瓶，半压塞装箱冻干，经检定合格后，即为冻干的疫苗产品。

本发明具体工艺方法为：

1.在长成单层的人胚肺二倍体细胞中，接种L-A-1株或H₂株毒种，32-362培养3-4周，之后收获感染的细胞悬液(又称疫苗原液)。

2.悬液合并后，在其中加入2％-10％的三氯甲烷，振荡使三氯甲烷充分溶解。三氯甲烷最佳使用量为6‰。

3.在孔径为100KD的超滤膜上进行全超滤，最终使分子量大于100KD的微粒沉积于膜表面。

4.使用Earle’s或其他缓冲液pH6.5-7.5冲洗膜包上沉积物，洗液液量为疫苗原液的3-6倍。

5.洗涤后，配制199疫苗液或磷酸缓冲液pH7.0-7.3收集沉积于膜上病毒微粒。

6.在收集到的悬液中加入冻干保护剂同时添加0.25-3‰的三氯甲烷，振荡使之溶解，三氯甲烷最佳使用量为2‰。

7.之后灌装西林瓶，每支0.5-1ml，半压塞装箱冻干，-35℃以下冻结3-4hr，开始干燥，制品在-20℃以下升华，待成形后，升温至28℃，控温7-9hr，冻干结束。

8.经检定合格即为冻干疫苗产品。

本发明具有以下优点和积极效果：

采用本发明的技术方案，能将以人胚肺二倍体细胞为基质制造的疫苗原液冻干成型，能有效保护病毒抗原，而工艺简单高效。在制品中添加的三氯甲烷，在洗涤和升华阶段已彻底除去(按《中国生物制品规程》(一部)(1995年版)中的方法测定)制品中不残留有机溶剂三氯甲烷。

实施例：

用胰酶(0.125％)消化细胞培养瓶上的感染细胞，加入100-250ml疫苗液或缓冲液，制成悬液，将悬液合并于3L钢瓶中，按合并的体积量加入6‰的三氯甲烷(A.R.)，然后将钢瓶放置在摇床上振荡20-40分钟或冻融1-2次，使三氯甲烷充分溶解。合并3L瓶中疫苗液于10L玻璃瓶中进行超滤(超滤器上装有100KD的膜包)。再以Earle’s或其他缓冲液pH6.0-7.5循环冲洗膜包，弃洗液，用1 99疫苗液收集膜上沉积的病毒颗粒，制成悬液。再加入保护剂[保护剂成份参见专利(申请号：98117802.2)]，同时添加2‰的三氯甲烷振荡使之溶解。灌装西林瓶，半压塞装箱冻干，预冻时间3-4hr，升华成型后，控温至28℃，7-9hr，冻干结束，包装后即为产品。