[发明专利]烟草为原料制备辅酶Q10的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域尤其是辅酶Q₁₀的制备辅酶Q₁₀(CoenzymeQ₁₀，CoQ₁₀)又称泛醌₁₀，是2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的衍生物，其侧链含有10个异戊烯基。它广泛存在于动物、植物和微生物中，是呼吸链中电子/氢的载体。它可以以NADH脱氢酶，磷酸甘油脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、铁硫蛋白等中接受电子/氢，并将电子传递给Cyt。因此，在呼吸链中占据承上启下的重要位置和作用。辅酶Q₁₀是重要的药源，在医药上广泛用于治疗心、脑、肝、肾疾病，细菌和病毒传染病，癌症病人的综合治疗，以及改善机体免疫功能等。

辅酶Q₁₀在国外用化学合成法或微生物发酵法生成，但产率低、产物专一性差，成本高，价格贵，难于满足制药工业需要。目前国内尚无生产，至今我国制药所需辅酶Q₁₀完全依赖进口。因此，辅酶Q₁₀在国内外都存在广阔的市场。以烟草为原料生产辅酶Q₁₀目前国内外都未见报道。

本发明的目的在于采用现代生物技术方法，利用植物细胞工程和酶工程的原理和技术，从发酵高产生长快的烟草细胞中制备高纯度的结晶辅酶Q₁₀，经济、简便的生产辅酶Q₁₀，以适应经济建设和国内外市场的需要。

我们从1994年起对烟草细胞发酵条件、工艺及其生产辅酶Q₁₀技术、辅酶Q₁₀的分离纯化、结晶纯度控制等技术进行了长期深入研究，从而发明了烟草为原料，以烟草细胞悬浮培养生产辅酶Q₁₀的技术。

本发明是这样实现的：

(一)愈伤组织诱导取烟草植体，洗净，70％乙醇溶液浸泡，再用0.1％氯化汞消毒，无菌水冲洗。在无菌条件下切碎，接种于诱导培养基上培养，置16-32℃培养箱中黑暗培养至形成愈伤组织，较理想的培养温度为28±1℃。诱导培养基以MS为基本培养基，加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8，高压灭菌。

(二)继代培养上述愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养，继代培养基以LS为基本培养基，另加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8，高压灭菌，产生疏松愈伤组织；

(三)悬浮培养出种子细胞：将上述疏松愈伤组织，转入悬浮培养基中进行悬浮培养出种子细胞。

1．悬浮培养基的组成

组   成          含量    最佳含量

无机营养          LS         LS

KT,mg/L         0.02-4     0.02

2,4-D,mg/L      0.05-4     2.00

肌醇mg/L        80-800     100

盐酸硫胺素mg/L  0.05-8.0   4.00

酵母膏％        0.05-0.5   0.15

蔗糖％          1045       30

甲硫酸胺mg/L    5-20       20.0

2．培养条件

☆摇床转速，100-150r/min，最佳转速为100r/min，振幅2cm

☆培养基pH,pH4.0-8.0，最佳pH5.8

☆培养温度，16-32℃，最佳培养温度为28±1℃

☆培养时间，8天

☆黑暗中培养

(四)辅酶Q₁₀的制备

1．辅酶Q₁₀的提取用丙酮作为抽提溶剂，将烟草悬浮培养细胞与丙酮按1：2(质量/体积比)混合，研磨，过滤，残渣重复2次以上，合并滤液，用0.5倍滤液体积的石油谜(30-65)℃作萃取剂进行萃取，所得石油醚萃取液为辅酶Q₁₀的石油醚提取液。