[发明专利]耐储藏水稻的筛选方法

说明书

本发明属于水稻种子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失体的快速比色筛选法，属于生物技术育种与开发领域，专用于包括常规稻和杂交稻的耐储藏品种(脂氧合酶-3缺失体)的快速筛选。

粮食安全是一个全球性的战略问题，我国是世界第一的人口大国，粮食储备更是政治稳定和国民经济长期高速发展的战略基础。水稻是我国的主要粮食作物，其产量占全国粮食作物的近一半；同时，大米是我国人民的主食，随着人民生活水平的不断提高，对大米的品质也提出了越来越严格的要求。但是，稻谷在一般储藏条件下第二年就会发生陈化变质现象，而且随着储藏过程中温度和湿度的加大，陈化过程更会迅速加快。近年来，我国粮食的连年丰收也使得稻谷储藏中的陈化问题越来越严重。据农业部统计，每年因为陈化问题损失的作为食用和种子的稻谷占总产量的3％。一般来讲，建设耐储的高标准低温冷库和气调库可提高稻米的储藏品质，但耗资巨大，是我国目前的经济能力所难以承受的，因此从储藏谷物本身来解决陈化变质问题无疑是一条经济有效的途径。研究表明，脂质的降解是导致谷物储藏期间品质下降并产生陈米霉味的根源。脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)是一种含非血红素铁的蛋白质，专一催化含有顺、顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其相应的酯类，从而氧化生成具有共轭双键的脂氢过氧化物，后者进一步转变成为一些挥发性的气体化合物。水稻种子中含有三种LOX同工酶，分别定名为LOX-1，LOX-2和LOX-3，最适pH为4.5，5.5和7.0，其中LOX-3活性约占总活性的80～90％。进一步的研究表明，水稻种子LOX能催化亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸的氧化，最终生成醛、酮等挥发性物质，产生陈米霉味，严重影响其耐贮性。LOX-3的缺失可以大大的阻止脂质的氧化作用，降低稻谷的氧化变质，使其不会因陈化变质作用而降低品质，保持谷物的清新气味。1993年，Suzuki等(见Japan J Breed，43：405-409)首次采用LOX-3的单克隆抗体技术发现泰国水稻品种Daw Dam是一种LOX-3的缺失体材料，其耐储藏特性也已被证实。上述LOX-3缺失体材料的发现，使通过遗传育种手段培育不含或低含量LOX的耐储藏水稻新品种成为可能。但是Suzuki等采用LOX-3的单克隆抗体技术进行筛选，其价格昂贵、步骤复杂，且一般育种工作者难以掌握该技术，迄今一些相关实验室也难以进行有关测定。因此，在大量的种质资源中筛选和在分离群体中选择耐储藏水稻新品系(LOX缺失体材料)时采用单克隆抗体技术是非常困难且不经济的。

本发明的目的是提供一种耐储藏水稻的筛选方法，筛选出水稻种子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失体，用该方法筛选水稻种子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失体具有简单、快速和低成本的特点，能鉴定包括各种常规稻和杂交稻的种子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失体材料，适用于水稻的遗传和新品种选育与开发。

实现本发明所提供的耐储藏水稻的筛选方法，所需步骤如下：

1)计量待测水稻和LOX-3缺失体材料(作为对照)的种子，切下种子单胚；

2)取单胚分别放入试管中；

3)在各试管中吸取0.5-1.5ml溶液A(含0.01-0.2％(V/V) Tween-20、0.5-5mmol/L亚油酸或亚麻酸、0.2-0.4mol/L pH8.2-9.0的硼酸缓冲液的溶液)，室温(20-30℃)下放置5-30min后，再分别加入50-400μl溶液B(含5-25％(V/V)醋酸、5-25％(V/V)饱和碘化钾的溶液)和50-400μl溶液C(0.5-5％(W/V)淀粉)；

4)4-50hr后观察待测水稻种胚和已知LOX-3缺失体材料种胚的反应显色差别，含有正常LOX-3活性的单粒种胚的试管均呈略带紫的橙红色或紫红色，LOX-3缺失的单粒种胚和LOX-3缺失体颜色则呈淡乳白色略偏黄。

5)该水稻种胚脂氧合酶-3(LOX-3)缺失体的筛选方法，也可以在4-50hr后以蒸馏水作为对照，比色测定410nm吸光值(A₄₁₀，下同)，计算待测水稻与LOX-3缺失体材料种胚A₄₁₀差异是否达到显著水平；判断待测水稻种胚LOX-3的缺失情况：样本与对照两者A₄₁₀差异呈显著或极显著水平，表明样本不是LOX-3缺失体；反之，则为缺失体。