[发明专利]编码poxB基因的新核苷酸序列

说明书

本发明涉及来自棒状细菌的编码poxB基因的核苷酸序列，和通过弱化poxB基因发酵生产氨基酸的方法。

L-氨基酸特别是赖氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或重要的调节代谢物缺陷的并产生氨基酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产L-氨基酸的菌株的改良。

本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。

L-氨基酸、尤其是赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。

本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列：

a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，

b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及

d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。

本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选包括能复制的DNA，含有

(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或

(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，

(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。

本发明还提供了

权利要求2的多核苷酸，含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，

权利要求2的多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，

含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，特别是pCR2.1poxBint，保藏在大肠杆菌DSM 13114中，

以及作为宿主细胞的棒状细菌，其含有pox基因的插入或缺失。

本发明还提供了多核苷酸，其基本上由多核苷酸序列组成，其可通过用具有相应于SEQ ID NO:1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包括具有相应于SEQ ID NO:1的所述多核苷酸序列的完整基因。

本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码丙酮酸氧化酶的全长cDNA，以及分离与丙酮酸氧化酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。

本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码丙酮酸氧化酶的基因的DNA的引物。

作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续碱基。具有至少40或50个碱基对的寡核苷酸也是合适的。

“分离的”是指从其天然环境中分离出来。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。

“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。

本发明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽，特别是具有丙酮酸氧化酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO:2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO:2的多肽至少80％、特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。

本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸特别是L-赖氨酸的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码poxB基因的核苷酸序列是弱化的，尤其是低水平表达的。

文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或抑制，例如通过用弱启动子或编码低活性相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及如果需要组合使用这些方法。