[发明专利]快速检测大肠杆菌和大肠菌群试剂盒及其底物的合成方法

权利要求书

1.一种用于快速检测大肠杆菌和菌群的试剂盒，包括以底物PNP-β-D-葡糖苷酸钠盐制成底物片，以胆盐乳糖增菌液制成培养基片，以磷酸盐配制0.2mol/L pH＝7.5缓冲液，将分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，组装成两片一水的试剂盒。

2.权利要求1所述快速检测大肠杆菌和大肠菌群的试剂盒，其特征在于制造方法：

a.底物、培养基均以纸片为载体，选用0.48mm厚滤纸，三种规格分别为直径6mm圆片，6.25mm×25mm条形，62.5mm×12.5mm条形；

b.底物片的制备：称取计算量的PNP-Glucu Na溶解，在无菌操作下浸吸备好的纸片，脱水后于40℃烘干，装入灭菌的棕色小瓶中，2-8℃避光密封保存。含底物分别约为100μg/片，1mg/片，5mg/片；

c.培养基片的制备：参考95年版药典培养基浓度半量计算，称取胆盐乳糖增菌溶液，高压灭菌，浸吸备好的纸片，脱水后60℃烘干，装入包装瓶内2-8℃密封保存。培养基约为4mg/片，20mg/片，200mg/片；

d.缓冲液的配制：按有关生化书籍，取一定量的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，制成0.2mol/L，pH＝7.5(PBS)缓冲液，高压灭菌后封口2-8℃保存。

e.组盒：将分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，就组成了试剂盒。

3.权利要求1所述的用于快速检测大肠杆菌和大肠菌群的试剂盒，其特征是检测方法为将试剂盒中的内容物缓冲液、底物片加入到被测的水样中，或各领域中经予处理的样品中，经37℃恒温箱孵育12-16小时，分解显现黄色为阳性，以无菌样作空白。

4.权利要求1所述的用于快速检测大肠杆菌和大肠菌群的试剂盒，其特征是底物PNP-β-D-葡糖苷酸钠盐的合成法如下：

a.四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯的制备

取葡糖醛酸内酯87.5g(0.5mol)，加入1mol/L甲醇钠15ml和无水甲醇485ml混合物，搅拌2h。减压蒸去甲醇，得糖浆。加入醋酸酐330ml，冰浴下滴加吡啶110ml，滴加温度在20℃以下，放冷，过滤粗品，用95％乙醇洗涤，再用95％乙醇重结晶脱色，得针状结晶四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯63.8g，产率35％，mp178-179℃。

b.三-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯的制备

取红磷9g，加90ml冰醋酸，冰浴搅拌下滴加54g(18ml)溴，维持20℃滴加，静止30min，过滤得橙黄色溴试剂，冰箱密封备用。

取四-O-乙酰基-D-葡糖醛酸甲酯20g，加入溴试剂80ml，室温搅拌溶解，冰箱过夜，次日在15毫米汞柱下，减压浓缩残留物用80ml氯仿溶解，先用水洗，再用饱和的碳酸氢钠溶液洗，分离氯仿层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸去氯仿，得糖浆。加少量无水甲醇溶解，放入冰箱冻室过夜，次日析出结晶三-O-乙酰基-α-D-溴代葡糖醛酸甲酯12.8g，产率62％，mp104-106℃(文献106-107℃)(冰箱密封保存)。

c.对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯的合成

取三-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯11.4g对-硝基苯8g，乙腈50ml，搅拌下缓缓加入新鲜的氧化银7.2g，搅拌2-3小时，过滤银盐，并用乙腈洗涤，合并滤液。减压蒸去乙腈，得糖浆，加无水乙醇，活性碳脱色，过滤，于冰箱内过夜，析晶，得闪亮结晶对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯6g，产率46.3％，mp154-155℃(文献154℃)。

d.对硝基苯-β-D-葡糖苷酸钠盐的制备

取对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯6g，加入0.2mol/L氢氧化钠20倍量(v/w)，4倍量95％乙醇，搅拌反应，不断补加氢氧化钠溶液，反应物溶解，共8小时，减压浓缩，得到对-硝基苯-β-D-葡糖苷酸钠盐固体。水-乙醇精制后得3.7g，收率81％，220℃(分解)(文献220℃分解)。

分子式：C₂H₁₂NO₉Na·H₂O，分子量：355.2

元素分析：理论值：C 40.50％，H 3.38％，N 3.94％

          实测值：C 40.16％，H 3.68％，N 3.93％

IR^KBr_max(cm-1)3200，3368(-OH)，1618(-COOH)，1239(C-O)1537，1394(C-NO₂)

HNMR(200MC，TMS内标，P20溶剂)δ：3.62(m，3H)，3.91(m，1H)，5.25(d，1H)，7.22(d，2H)，8.23(d，2H)