[发明专利]快速检测大肠杆菌和大肠菌群试剂盒及其底物的合成方法

说明书

本发明涉及一种生物检测方法，尤其是一种大肠杆菌和大肠菌群的快速检测方法。

大肠杆菌和大肠菌群是国际上公认的药品，食品、临床检验、环境监测、卫生防疫等领域中通用的指标。其检测方法多采用传统的发酵、分离生化检验及多管发酵和膜过滤法。这些方法的主要缺点是操作繁琐、耗时长、成本高，一般需3～5天时间，有可能导致病情的延误，以及物品、食品迟销造成经济损失。

本发明所述试剂盒的底物

本发明的目的在于提供一种能够准确、简便、快速、低成本的检测大肠杆菌及大肠菌群试剂盒，并提供该试剂盒所用底物PNP-β-D-葡糖苷酸钠盐技术路线合理、工艺稳定、收率高、成本低的合成方法。

本发明PNP-葡糖苷酸(盐)快速检测大肠杆菌及大肠菌群试剂盒属酶学检测大肠杆菌及大肠菌群。其原理是根据大肠杆菌及大肠菌群中特异性含有β-葡糖苷酸酶(B-G)，在适宜的环境下，与底物PNP-葡糖苷酸(盐)反应，将底物分解成色团(PNP)形成黄色，反应式如下：

依据以上原理，以底物PNP-β-D葡糖苷酸钠盐制成底物片，以胆盐乳糖增菌液制成培养基片，以磷酸盐配制0.2mol/L pH＝7.5缓冲液。将分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，组装成两片一水的试剂盒。

本发明所述的试剂盒是以如下方法制成的：

1、底物、培养基均以纸片为载体，选用0.48mm厚滤纸，三种规格分别为直径6mm圆片，6.25mm×25mm条形，62.5mm×12.5mm条形。

2、底物片的制备：称取计算量的PNP-Glucu Na溶解，在无菌操作下浸吸备好的纸片，脱水后于40℃烘干，装入灭菌的棕色小瓶中，2-8℃避光密封保存。含底物分别约为100μg/片，1mg/片，5mg/片。

3、培养基片的制备：参考95年版药典培养基浓度半量计算，称取胆盐乳糖增菌液溶，高压灭菌，浸吸备好的纸片，脱水后60℃烘干，装入包装瓶内2-8℃密封保存。培养基约为4mg/片，20mg/片，200mg/片。

4、缓冲液的配制：按有关生化书籍，取一定量的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，制成0.2mol/L，pH＝7.5的(PBS)缓冲液，高压灭菌后封口2-8℃保存。

5、组盒：装分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，就组成了试剂盒。

根据被测样品不同，试剂盒分为两种规格。

(1)适合医院临床、药检、水检增菌后浓集后等微量取样的试剂盒，见表1。

                表1  I型试剂盒(适合100μl取样)

    试剂盒内容物    规格    近似含量    底物片瓶    φ6mm×50    100μg/片    培养基片瓶    φ6mm×50    4mg/片    缓冲液瓶    0.2mol/L pH 7.5    10ml/瓶(2)适合环保检测的试剂盒，见表2。