[发明专利]新蛋白质,其编码基因及它们的使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有抗微生物活性的新蛋白质，编码该蛋白质的基因和使用所述蛋白质和基因的方法。更具体地，本发明涉及源自Lyophyllum shimeji，并具有至少抗茄属丝核菌和Pyricularia oryzae的抗微生物活性的蛋白质，编码该蛋白质的基因，和使用所述蛋白质和基因的方法。

本申请要求1999年9月21日提交的日本专利申请267238/1999(其全部内容列入本文作为参考)的优先权。

背景技术

已知如壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的裂解酶是具有抗植物致病性微生物的抗真菌或抗微生物活性的植物蛋白质。体外实验证实：尽管这些类型的酶单独使用时可以发挥作用(Schlumbaum等，(1986)，自然324，pp365-367，Broglie等，(1991)，科学254，pp1194-1197)，但如果联合使用两种或多种上述酶，一般会获得增强的作用(Mauch等，(1988)，植物生理学，88，pp936-942；Sela-Buurlage等，(1993)，植物生理学，101，pp857-863)。如果用于抑制真菌生长，已知当单独使用这些裂解酶时，需要其使用浓度约为几十至几百μg/ml，或者当联合使用这些酶时，每种酶的浓度约为几μg/ml。然而，就本发明人所知道的而言，至今尚未阐明这些裂解酶能够对导致水稻作物大面积受损的Pyricularia oryzae发挥任何抗微生物作用。

以防卫素为例的低分子量抗真菌肽(AFP)也具有抗微生物活性，据报道其中的Ca-AMP1(日本国內公告号505048/96)和CB-1(Oita等，(1996)，Biosci.Biotech.Biochem，60，pp481-483)显示出抗Pyricularia oryzae和茄属丝核菌的抗微生物活性。而Rs-AFP1和Ar-AFP2(Terras等，1992，生物化学杂志，267，pp15301-15309)，以及Ace-AMP1(日本国内公告号501424/97)显示出抗Pyricularia oryzae的抗微生物活性。几μg/ml这些低分子量肽能50％抑制包括上述微生物的植物致病性微生物的生长。

人们也尝试分离裂解酶基因或低分子量抗微生物肽基因，并将这些基因转移至植物，从而构建能耐受疾病损伤的植物(Broglie等，(1991)，科学，254，pp1194-1197；Zhu等，(1994)，Bio/Technology12，pp807-812；Lin等，(1995)，Bio/Techmology13，pp686-691；Terras等，(1995)，植物细胞7，pp573-588)。然而，迄今为止几乎无法得到任何被赋予实践可接受水平的耐受性的植物。据认为一个原因是仅表达了低水平的转移基因。然而，据认为更主要的原因是迄今为止所报道的抗微生物蛋白本身具有很低的抗微生物活性。因此，需要鉴定和利用抗微生物活性比现有技术中的更高的抗微生物蛋白。

发明简述

本发明的目的是筛选和鉴定新的抗微生物蛋白，浓度甚至相对较低的该蛋白质也能抑制多种植物致病性微生物的生长，所述微生物包括Pyriculariaoryzae和茄属丝核菌，它们能导致影响水稻的两种主要疾病。

本发明的另一方面是克隆编码所述新蛋白质的基因并测定其碱基序列。

本发明的另一方面是将本发明的基因导入宿主生物(微生物，动物，植物等)以构建转化体，从而使用本发明的基因。

本发明的另一方面是提供抗微生物剂，其含有本发明的抗微生物蛋白。

附图简述

图1显示了通过使用MonoQ柱分离的Lyophyllum shimeji蛋白质图与其抗微生物活性之间的关系。

图2显示了通过MonoQ柱分离的Lyophyllum shimeji蛋白质的电泳模式与其抗微生物活性之间的关系。泳道上方给出的数字分别对应于图1中的级分编号，而M表示分子量标记。泳道下方给出的符号(-，+，++，+++)表示抗微生物活性的强度。箭头表示抗微生物蛋白(70kDa和65kDa)。

发明详述