[发明专利]采用多种DNA聚合酶的DNA测序方法和所用的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及DNA核苷酸序列分析方法和所用的试剂盒，更具体地，涉及通过对DNA核苷酸序列进行一次分析而比常规方法能更准确地分析DNA全长核苷酸序列的DNA核苷酸序列分析方法和试剂盒。

背景技术

已经知道，桑格双脱氧核苷酸介导的链终止法是用于分析DNA核苷酸序列的常规方法。在桑格法中，DNA核苷酸链通过和在戊糖的C-3位含有取代的羟基的脱氧核苷酸(dNTP)反应而延长，并通过和在戊糖的C-3位不含有取代的羟基的双脱氧核苷酸(ddNTP)反应而终止。

在桑格法中，四种dNTP如脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)用作产生与模板DNA互补的DNA片段的底物。四种ddNTP如双脱氧鸟苷三磷酸(ddGTP)、双脱氧腺苷三磷酸(ddATP)、双脱氧胸苷三磷酸(ddTTP)和双脱氧胞苷三磷酸(ddCTP)用作用于终止互补DNA片段的链延长反应的底物。与dNTP不同，ddNTP在戊糖的C-3位不含有羟基。因此，当ddNTP和延长反应中的互补DNA片段的末端反应时，互补DNA片段的链延长反应被终止。

因此，在桑格法中产生了不同长度的其末端被ddNTP终止的DNA片段。在桑格法中，产生了与模板DNA的核苷酸数目相对应的不同的互补DNA片段，进而通过电泳，按分子量的顺序将其进行分离。之后，通过测定每个互补DNA片段的末端碱基来识别模板DNA的核苷酸序列。

然而，尽管桑格法很方便，但是它的一个缺陷在于，由于互补DNA延长反应的持续合成能力是有限的，只有长度在500-700bp的DNA可以被准确测定。例如，为了准确和完整地识别平均长度为2Kb的人类cDNA，DNA测序步骤需要通过对人类cDNA的分割来重复三次以上。如上所解释的，作为长DNA的测序方法，桑格法是一种费时、费力和昂贵的方法。

同时，在所谓的鸟枪法(已知是用于基因组DNA的大规模核苷酸测序方法)中，全长DNA被分割为几个DNA片段，分别识别每个片段的碱基的序列。之后，使用计算机相互比较每个片段的序列，通过删除重叠部分来分析全长DNA序列。在上述鸟枪法中，利用可通过一次DNA序列分析识别的DNA长度的扩展来缩减全长DNA序列分析所需的时间和劳力。

通常，在常规的桑格双脱氧核苷酸介导的链终止方法中，采用单个的DNA聚合酶。因此，对应于模板DNA 20-30bp的短DNA片段和对应于模板DNA 600-700bp的长DNA片段少量生成。然而，对应于模板DNA 40-500bp的DNA片段大量生成。所以，短DNA片段和长DNA片段的含量相对较低，从而DNA两端末端部分的核苷酸序列比其中间部分难以测定。

由于上述原因，可通过对核苷酸序列的一次分析进行分析的DNA的长度实际上受到限制。因此，人们长期以来为得到一种新方法进行了多种研究，该方法应能扩展通过核苷酸序列的一次分析来识别的DNA长度，所述核苷酸序列的一次分析是借助对模板DNA两端末端部分更准确的测定进行的。

发明的公开

因此，本发明的目的在于提供一种通过核苷酸序列的一次分析测定较长DNA序列的方法以及该方法所用的试剂盒。本发明的方法是对常规桑格DNA测序方法的改进，它可以用于测定比可由桑格测序方法所测定的更长的DNA。

本发明的目的可以通过提供一种DNA序列分析方法来实现，该方法采用了两种以上的DNA聚合酶，该聚合酶包括其对ddNTP的亲和力高于常规桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶，和其对ddNTP的亲和力低于常规桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶。

更具体地，其对ddNTP的亲和力高于桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶大量产生相对短的DNA片段，而其对ddNTP的亲和力低于桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶则大量生成相对长的DNA片段。因此，通过本发明的方法，同时采用对ddNTP的亲和力相互不同的多种DNA聚合酶，可以无差别地得到从10bp到大于1,000bp的不同长度的DNA片段。所以，对于那些比可通过常规桑格法分析的DNA片段还长的DNA片段，可以通过本发明的方法进行DNA序列分析。