[发明专利]BHV－l基因缺失的病毒疫苗

说明书

1.发明领域

本发明主要涉及重组牛疱疹病毒疫苗及其相应的构建方法。具体说，本发明涉及传染性重组牛疱疹病毒I型(BHV-I)的构建，其缺失天然糖蛋白E(gE)编码区，在gE基因座上插入了功能性β-半乳糖苷酶基因(β-gal)。天然gE编码区的缺失使该病毒减毒，且可作为基因型或免疫学标记，可将缺失gE的重组病毒与天然类型的病毒感染区分开。另外，插入β-gal基因提供一种通过宿主细胞中β-gal活性的表达，来检测是否存在缺失gE的重组病毒感染的表型方法。

2.现有技术的描述

牛疱疹病毒I型(BHV-I)，也称为传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)，与牛的许多临床疾病相关，包括鼻气管炎、结膜炎、生殖道感染和偶然性流产、肠炎、脑炎和牛全身系统的感染。BHV-I基因组由约140kb的线性dsDNA分子构成。由侧接于内部和反向末端重复序列(分别为I_R和T_R)的单一长(U_L)区域和单一短(U_S)区域构成。BHV-I基因组编码约70种蛋白质(Misra等人，牛疱疹病毒1的特异性蛋白质(传染性牛鼻气管炎，J.Virol.40：367-378(1981)))。与其他几种动物的疱疹病毒相似，BHV-I基因组编码糖蛋白(g)gE基因。已报道了两种不同的菌株BHV-IgE基因序列，其编码575氨基酸(aa)残基(Leung-Taek，P.等人，“牛疱疹病毒I型菌株(ST株)短单一区域(U_S)的完整DNA序列和基因组成”，Virology 199：409-421(1994)；Rebordosa，X.等人，“对牛疱疹病毒I型的编码糖蛋白的基因(与HSV-1的gE基因同源)的作图、克隆和测序”，Gene，149：203-209(1994))。预计gE氨基酸在N端(推定的信号序列)和C端(跨膜序列)附近含有几段疏水性氨基酸，其通常是I类膜内在蛋白质。已显示BHV-IgE和其在其他疱疹病毒中的同类物在体外复制中不是必须的，但假性狂犬病病毒(PRV)基因组整个gE编码序列的缺失将导致活疫苗菌株Norden和Bartha的毒性减少(Petrovskis，E.A.等人，“假性狂犬病病毒疫苗菌株中的缺失和它们对合成糖蛋白gp63的影响”，J.Virol.60：1166-1169(1986))和神经侵袭性的改变(Card，J.P.等人，“在大鼠目视系统的感染中假性狂犬病病毒包膜糖蛋白gI影响向神经性和毒性”J.Virol.66：3032-3041(1992))。所以，在动物病毒的全致病效力中需要gE基因的表达但在组织培养物的生长中则不需要(Kritas等人，“鼻内接种后在猪三叉神经路径中假狂犬病病毒(ADV)单一糖蛋白缺失突变体的侵入和蔓延”，Vet.Microbiol.50：323-334(1994)；Kritas等人，“在猪嗅觉神经路径中假狂犬病病毒的侵入和蔓延中包膜糖蛋白gI、gp63和gIII的作用”，J，General Virol，75：2319-2327(1994))。

最近，人们产生了将PRV和IBR的缺失gE基因的突变体用作不同标记疫苗的兴趣。近期，欧洲正将缺失gE的标记疫苗用于根除IBR。但欧洲的这种gE缺失型疫苗菌株没有β-gal标记物，这种标记物可以用于检测β-gal酶活性的原位组织化学方法和检测β-gal蛋白质的原位组织化学方法和免疫印迹方法。β-gal的编码区也可作为该重组病毒的基因型标记物。不难用Southern印迹杂交检测此病毒，也可用PCR测试来确定野生型疫苗病毒的遗传纯度。所以，需要的是一种无毒的gE缺失型IBRV菌株，其含有合适的表型/组织化学/基因型β-gal标记物。

发明概述

已构建了一种BHV-I重组病毒(gEΔ3.1IBRβ)，该病毒中缺失了含有编码gE基因序列部分的gE开放读框(ORF′s)，在其位置插入了一嵌合的报道基因/标记基因。这种插入的β-半乳糖苷酶(β-gal)基因在病毒的复制中无调节作用，但可作为gEΔ3.1IBRβ病毒的表型标记物。