[发明专利]人肝脏祖先

说明书

发明领域

本发明涉及人肝脏干细胞、生成肝脏细胞和胆管细胞的多能细胞，以及能够扩增和分化为包括造血、间充质或肝脏细胞谱系在内的其它肝脏远祖细胞亚群。特别是，本发明涉及用于鉴定人肝脏祖先的标记和特性、人肝脏祖先的纯化和低温保藏方法、使人们能够区分肝脏细胞亚群与造血细胞亚群的新方法以及证明肝祖先从胎儿到成年在人肝脏中存在的证据。本发明构成细胞和基因治疗以及建立人工生物器官的基础。

背景技术

成熟肝脏基本的结构和功能单位是腺泡，其横断面的组织形式象围绕两个独特的血管床的轮子：3-7套肝三联(每套有一个门小静脉、肝小动脉和一个胆管)位于外周、中央静脉位于中心。肝脏细胞彼此组织构成细胞板，在其两侧排列有帘式内皮膜，形成一系列的与门脉管和中央血管系统相邻近的窦状隙。最近的数据表明肝闰管(Canals of Herring)，即位于每个肝三联周围的小管，在整个区带I产生细小的小管，它们延伸并切入肝板，形成与瓶刷子相似的结构式样。(Theise，N.1999，肝脏学(Hepatology)，30：1425-1433)。

一个称作迪塞间隙(Space of Disse)的狭窄空间，一直沿着窦状隙将内皮膜与肝脏细胞分隔开。作为这种组织结构的结果，肝脏细胞具有两个基部区(其中的每一个面向一个窦状隙)和一个顶部区。基部区接触血液并参与血浆成分的吸收和分泌，而顶部区则形成专门分泌胆汁盐的胆汁小管并通过交联网络与胆管相连。血液从门小静脉和肝小动脉流过窦状隙到达末端肝小静脉和中央静脉。

基于这种循环形式，将腺泡分为三个区带：区带1，门周区；区带2，腺泡中区；和区带3，中心周围区。增殖潜能、形态规范、(染色体)倍性以及大多数肝脏特异性基因与区带定位相互关联(Gebhardt，R等人，1988，FEBS Lett.，241：89-93；Gumucio，J.J.，1989，Springer International，Madrid；Traber，P.等人，1988，胃肠学(Gastroenterology)，95：1130-43)。跨腺泡的血液成分(包括氧气)浓度梯度以及沿着从肝三联到中央静脉的血流方向承担这种区带化的一部分，例如，糖酵解和糖异生的彼此区室化。然而，门周区带形成中的间隙连结蛋白质(连结蛋白26)以及中心周围区带形成中的谷氨酰胺合成酶(这里仅列举两个例子)对这样的梯度并不敏感，而更代表了大多数组织特异性基因，并看来好象取决于微环境中对细胞或非血流变量而言为内源性的因子。

除了肝脏细胞、胆管上皮细胞(胆管细胞)和内皮细胞外，位于门脉和中央静脉区段间的区域含有其它细胞类型，诸如Ito细胞和库佛细胞(Kupffer cell)。这些细胞在肝脏的疾病状态中扮演突出的角色，特别是在炎症和纤维化中，但是表面看来，它们对正常器官主要的自身稳定功能的贡献并不大。

肝脏是盲肠囊(形成自前肠尾和原始横隔，它们内脏间充质的一部分)汇聚发育的结果。肝脏细胞的形成，很可能是通过成纤维细胞生长因子，始于内胚层上皮与生心中胚层的相互作用之后。接着，注定为肝脏细胞的细胞增殖并以索状方式穿入原始横隔的间充质，形成肝脏原基。上皮-间充质的直接相互作用在肝脏的这些早期发育阶段中是至关重要的，并决定哪些细胞将分别成为肝脏细胞或胆管细胞和帘式内皮膜。间充质特异性基因hlx和jumonji的突变将阻断肝脏发育，从而表明来自该组织的贡献的重要性。在肝脏发育的早期，肝脏含有原始的肝脏细胞簇(与缺乏基底膜的连续内皮和丰富的造血细胞相邻接)。由于内皮细胞转化为不连续的帘式内皮膜，所以脉管系统，特别是门脉管系统随着基底膜的产生变得更加发达。门小间隙可以提供胆管发育的触发器，并且由于它包围着门小静脉、肝小动脉和胆管，所以形成了肝三联。很可能是为了响应诸如C-CAM105、Agp 110、E-钙粘蛋白和连结蛋白这样的组织-形成分子在数量和分布上的变化，未成熟肝脏细胞快速增殖并形成实质板，同时伴有绝大部分(但不是全部)造血细胞再定位于骨髓。最近的研究提示某些造血细胞祖先存留于休眠的成年啮齿类的肝脏中，并且已从成年人类和鼠的肝脏中分离出造血干细胞(Crosbie，O.M.等人，1999，肝脏学(Hepatology)，29：1193-8)。在啮齿类中成熟的物理组构是在出生后的几周内完成的，在人类中是在头几年。代谢的区带化是根据不同的酶采取多少有些不同的安排而建立的，但在出生后的时期代谢的区带化变得明显起来。干细胞和定向祖先