[发明专利]蛋白质的分离和分析

说明书

本发明涉及尤其是通过质量分析来分离和分析蛋白质。本发明尤其可应用于分离诸如抗体之类的结合蛋白。本发明也提供对蛋白质或蛋白质片段的修饰，以便有助于质量分析和或分离由基因文库成员编码的特定蛋白质。

关于蛋白质分离，本发明提供了借助与特定靶的结合而从这类蛋白质的复杂混合物中分离特定蛋白的新方法。具体地说，本发明提供借助于与特定靶抗原的结合而从基因文库衍生的这类抗体结构域混合物中分离特异性抗体结构域的方法。对于蛋白质的分析，本发明提供用于分析复杂的蛋白质混合物、尤其是用于比较两种或更多种不同样品之间的蛋白质的新方法。

对于借助于与特定靶的结合从复杂混合物中分离蛋白并且在该蛋白的身份或氨基酸序列预先未知的情况下，分离足够的与所述靶结合的蛋白以对该蛋白进行直接表征通常是非常困难的。为了从天然的、合成的或半合成的蛋白的大文库中选择目的蛋白，已经开发了“蛋白展示”法，用该方法产生在物理上与其基因相连接的重组蛋白，使得所述蛋白的回收使得随后可以快速回收所述基因。这类方法包括“体内”展示法诸如在噬菌体(“噬菌体展示”)、细菌和酵母上的展示，还包括“体外”展示法诸如在核糖体上的展示(“核糖体展示”)。可以对所回收的基因进行测序，以便确定所回收蛋白的身份，或可以用所回收的基因再生所述回收的蛋白。如果对基因文库进行蛋白展示法，藉此根据特定特性例如与抗原结合(对于抗体可变区)选择蛋白，那么在每轮选择后，所回收的基因将富集编码显示这类特定特性的蛋白的基因。目前的“体内”展示法的缺点包括：对所展示的功能蛋白量的限制(噬菌体展示通常限于小于40kDa的多肽)，通常需要将重组蛋白与宿主蛋白融合(这可能干扰重组蛋白的功能或结合)，以及不能改变每个展示粒子所展示的蛋白数；后者也是“体外”展示法诸如核糖体展示的问题。另外，因为展示粒子的体积小，对于具有特定特性例如与抗原结合的蛋白的选择方法是有限的，使得不容易使用诸如荧光激活细胞分类(FACS)的方法。因此，仍需要发展新方法，以改进从复杂混合物中分离蛋白、特别是改进从复杂的抗体可变区(Fv)混合物中分离Fv。亦即本发明提供从复杂混合物中分离蛋白的改进方法。具体地说，本发明将由基因文库产生的蛋白文库的应用与质谱法改进、特别是基质辅助激光解附/电离飞行时间(MALDI-ToF)质谱的改进和通过串联质谱(MS-MS)对ToF分离的肽直接测序的能力、最近将ToF和MS/MS结合进一个装置(Q-ToF)的能力以及将HPLC和电喷雾(ES)串联质谱结合的能力相结合。本发明也包括从复杂的蛋白混合物中筛选个别蛋白的新方法，用所述方法不用将这些蛋白“展示”，即在所述蛋白与所述靶结合期间或之后将这些蛋白与其相应的基因结合。本发明也包括从复杂的蛋白混合物中筛选个体蛋白的新方法，用所述方法所述蛋白以及所述靶均不用“展示”，即与任何其它分子或结构结合。本发明也包括从复杂的蛋白混合物中筛选个体蛋白的新方法，用所述方法，所述蛋白及其相应的基因通过加入或包括一个“结合部分(associating moiety)”连接在一起，从而在加入所述“结合部分”或者之前或者之后所述蛋白与所述靶结合。

因此，在第一方面，本发明提供一种蛋白鉴定、筛选和/或测序的方法，包括提供个别蛋白的文库，所述个别蛋白中的一种或更多种可以与感兴趣的靶结合，其中每种个别蛋白在其序列中包括一个“条形码”序列，该序列可以用来在该文库中鉴定每种个别蛋白。