[发明专利]农杆菌介导的棉花转化的改进方法

说明书

本发明涉及植物转化领域，具体地说涉及一种农杆菌(Agrobacterium)介导的棉花转化的改进方法。

棉花是一种重要的农作物，种植棉花主要为了获得棉绒，这为纺织工业提供许多高质量的纤维。棉籽也是一件有价值的商品，因为它提供了油，粗粉和种子外壳的来源。

世界范围种植的棉花的大约90％是陆地棉(Gossypium hirsutumL.)，而海岛棉(Gossypium barbadense)占大约8％。

通过常规育种技术获得了各种品质特性的改进，如对虫害，逆境或者病害的抗性，纤维质量，降低的棉子酚含量，利用分子和遗传技术可以进一步改进这些和其它品质。

有可用于棉花转化的几种方法，包括棉花外植体，如离体的子叶、离体的下胚轴和离体的下胚轴过渡区的农杆菌介导的转化，以及通过对棉花分生组织的微粒轰击的直接基因转化。

Firoozabady等(1987，第10期，植物分子生物学(Plant MolecularBiology)：105-116)描述了通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和转基因植物的再生转化棉花子叶组织的方法。

Umbeck等(1987，第5期，生物/技术(Bio/Technology)：263-266)报告了利用下胚轴作为外植体经由农杆菌在棉花转化上的结果。

PCT出版物(“WO”)89/05344，美国专利(“US”)5,244,802和US 5,583,036提供了通过组织和悬浮培养，用为下胚轴，子叶和不成熟胚的外植体开始再生棉花的方法。也教导了通过选择性生长转化棉花和改良棉花的方法。

WO 89/12102和US 5,164,310涉及一种用于转化和迅速再生植物组织的新方法。该方法使用茎顶端作为目标组织，进而扩大了转化的种的范围和减少体细胞克隆变异的风险。

WO 98/15622提供了用于可育的棉花(Gossypium)植物的体外再生的方法，其中去除和培养来自小苗的过渡区组织的细胞。也描述了用于产生能够向后裔传输外源基因的转基因棉花植物的方法，其中源于小苗的过渡区组织的细胞是转化的目标。

WO 97/12512提供了一种从外植体组织再生棉花植物的方法，它能从不在含外源植物激素的愈伤组织诱导起始培养基上培养的棉花组织外植体，如下胚轴产生胚胎发生愈伤组织。该方法可用于农杆菌介导的棉花植物的转化。

US 5,004,863和US 5,159,135以及欧洲专利出版物“EP”0 270 355都公开了通过把未成熟的棉花组织如下胚轴片段在体外经农杆菌介导的遗传转化，完成棉花植物和品系的遗传转化的方法。

WO 97/43430涉及多用途的从顶端和/或节间分生组织的外植体迅速再生棉花植物的方法，它可与已熟知的转化方法如农杆菌介导的转化结合在一起，快速产生具有农艺重要性的遗传工程棉花品种。

WO 92/15675和EP 0 531 506描述了用于粒子介导的棉花转化的方法，无需组织培养或愈伤组织增殖，包括从发芽种子切去胚轴和用携带外源基因的颗粒轰入胚轴中即可直接对优良棉花品系进行遗传工程改良。

Finer和Mc Mullen(1990，植物细胞报告(Plant Cell Reports)，8：586-589)描述了经由胚胎发生悬浮培养物的粒子轰击转化棉花的方法。

McCabe和Martinell(1993，生物/技术11：596-598)描述了通过从切除的胚轴的棉花分生组织的粒子轰击对优良棉花品种的转化方法。

Hansen等(1994，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)91.7603-7607)曾描述了一种农杆菌菌株，它包含一个组成型的virG突变体(virGN54D)，导致分离的棉花子叶转化效率的提高。

Veluthambi等(1989，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第171期：3696-3703)描述了在侵染时同时添加乙酰丁香酮和胭脂氨酸显著地增加棉花茎尖转化的方法。

正如Murray等所指出的(1993，转基因植物，第2卷，Academic出版公司p153-168)，现有技术的棉花的农杆菌介导的转化方法有很大的缺点，即从与农杆菌细胞共培养的外植体再生转基因植物需要的时间太长。