[发明专利]1,3－丙二醇脱氢酶突变体

说明书

发明领域

本发明涉及一种1，3-丙二醇脱氢酶突变体，其对于1，3-丙二醇的米氏常数有所改变。本发明提供了1，3-丙二醇脱氢酶突变体的核酸和氨基酸序列。本发明同时提供了1，3-丙二醇脱氢酶突变体的表达载体和宿主细胞。

发明背景

1，3-丙二醇是在聚酯纤维、聚氨基甲酸酯和环状化合物生产中有潜在用途的单体分子。1997年11月11日授予的美国专利号5,686,276和WO 98/21341已经公布了1，3-丙二醇的生产方法。由葡萄糖生产1，3-丙二醇的过程中一个有代表性的途径包括以下几个步骤。葡萄糖在糖分解途径中的酶的作用下，经一系列步骤被转化成二羟基丙酮磷酸(DHAP)和3-磷酸甘油醛(3-PG)。接着，DHAP水解成二羟基丙酮(DHA)然后还原成甘油，或者DHAP被还原成3-磷酸甘油(G3P)然后水解形成甘油。水解反应可以由已知对底物特异或非特异的多种细胞磷酸酶催化，或者这种活性可以通过重组导入宿主。还原反应步骤被以NAD+(NADP+)为辅酶的宿主酶催化，或者这种活性可以通过重组导入宿主。已经知道dha调节子含有甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)，能够催化可逆反应3。甘油3-HP+H₂O                    (反应1)3-HP+NADH+H⁺1，3-丙二醇+NAD⁺    (反应2)甘油+NAD⁺DHA+NADH+H⁺            (反应3)

如上所示，甘油先被转化成中间体3-羟基丙醛(3-HP)，然后被转化成1，3-丙二醇。中间体3-HP是甘油在宿主编码的或重组到宿主细胞的脱水酶的作用下产生的(反应1)。这个脱水酶可以是甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)、二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)或者其他能够催化这个反应的任何酶。甘油脱水酶是由dha调节子编码的。1，3-丙二醇是由3-HP，在以NAD⁺(NADP⁺)为辅酶的宿主酶或者被重组到宿主中的酶的作用下形成的(反应2)。生成1，3-丙二醇的最后反应可以被1，3-丙二醇脱氢酶(E.C.1.1.1.202)或者其他醇脱氢酶催化。

在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中，编码甘油脱水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)和二羟基丙酮激酶(dhaK)功能性相关活性的基因都存在于dha调节子中。柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌的dha调节子已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达，并显示可以把甘油转化成1，3-丙二醇。

一种1，3-丙二醇脱氢酶的核酸和氨基酸序列已经在现有技术中被公布，包括肺炎克雷伯氏菌GenBank U30903号(Williard，1994，“肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇途径的研究：甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶的性质和表达”，化学工程学论点(Thesis ChemicalEngineering)，威斯康星大学曼狄逊)；弗氏柠檬酸杆菌GenBankU09771号(Daniel等，1995，从弗氏柠檬酸杆菌中纯化1，3-丙二醇脱氢酶：克隆、测序和在大肠杆菌中表达相关基因，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，177：2151-2156)：巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)GenBank AF006034号(Luers等，1997，巴氏梭菌把甘油转化成1，3-丙二醇：克隆和表达编码1，3-丙二醇脱氢酶的基因，FEMS Microbiol Lett.154：337-345)。

发明概述

本发明涉及从能够在至少105克/升1，3-丙二醇存在下生长的蟑螂埃希氏菌(E.blattae)衍生物中(这一浓度对野生型蟑螂埃希氏菌是致死的)分离得到的突变形式1，3-丙二醇脱氢酶(PDD)。因此，本发明部分基于发现PDD突变形式与蟑螂埃希氏菌突变体能够耐受高毒性浓度1，3-丙二醇相关。本发明也部分基于发现这个突变PDD对1，3-丙二醇和NAD的米氏常数有所改变。