[发明专利]一种使用微孔识别DNA突变的方法及为此提供的试剂盒

权利要求书

1.一种使用微孔识别DNA突变的方法，其包括以下步骤：

(i)使用一个结合了生物素的引物，通过PCR制备一部分待识别的DNA序列的扩增的生物素化的DNA片段；

(ii)制备一个包含与待识别的DNA序列相对应的正常序列的探针；

(iii)将步骤(ii)中制备的探针固定到微孔的胺基上；

(iv)将步骤(i)中制备的生物素化的DNA片段加入到固定了探针的微孔中；

(v)为使降解酶与探针捕获的样品DNA片段的生物素部分结合，将一种连接了链霉抗生物素的降解酶加入到微孔中；

和

(vi)加入一种将与降解酶反应的底物，并检测由底物的降解所引起的颜色或吸光度变化。

2.权利要求1所述的识别DNA突变的方法，其中探针为含有10个以上核苷酸并在5’端位包含一个磷酸酯部分的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的识别DNA突变的方法，其中步骤(iii)包括向微孔中加入单链探针；为将单链探针的磷酸酯部分结合到微孔的胺基上，加入催化剂；和洗涤微孔。

4.权利要求3所述的识别DNA突变的方法，其中催化剂为10mM1-甲基咪唑，pH值为7.0的冰冷溶液和10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亚胺(EDC)，pH值为7.0的冰冷溶液。

5.权利要求3所述的识别DNA突变的方法，其中洗涤通过使用0.4M NaOH/0.25％吐温-20溶液进行。

6.权利要求1所述的识别DNA突变的方法，其中步骤(iv)包括将步骤(i)获得的单链DNA片段与微孔的探针结合；除去残余的DNA片段；和洗涤微孔。

7.权利要求6所述的识别DNA突变的方法，其还包括在将步骤(i)获得的单链DNA片段加入到微孔中之前，用含有dH₂O、20×SSPE/0.0167％Triton X-100和鲑鱼精子DNA(10mg/ml)的溶液在50℃下，预处理微孔20分钟。

8.权利要求6所述的识别DNA突变的方法，其中将步骤(i)获得的DNA片段与探针的结合在含有dH₂O、20×SSPE/0.0167％Triton X-100和鲑鱼精子DNA(10mg/ml)的溶液中进行。

9.权利要求6所述的识别DNA突变的方法，其中洗涤通过使用0.5×SSC/0.1％吐温-20溶液进行。

10.权利要求1所述的识别DNA突变的方法，其中步骤(v)包括第一次洗涤微孔；将连接了链霉抗生物素的降解酶加入到微孔中以使酶与生物素结合；除去残余的反应混合物；和第二次洗涤微孔。

11.权利要求10所述的识别DNA突变的方法，其中第一次洗涤通过使用含有150mM NaCl/0.1％吐温-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液进行。

12.权利要求10所述的识别DNA突变的方法，其中连接了链霉抗生物素的降解酶为溶于含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中的链霉抗生物素-碱性磷酸酶。

13.权利要求10所述的识别DNA突变的方法，其中第二次洗涤包括在60℃下，用含有150mM NaCl/0.1％吐温-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液处理微孔10分钟。

14.权利要求1所述的识别DNA突变的方法，其中将与连接了链霉抗生物素的降解酶反应的底物为在降解过程中显示颜色或吸光度变化的合成肽。

15.权利要求14所述的识别DNA突变的方法，其中如果使用链霉抗生物素-碱性磷酸酶作为连接了链霉抗生物素的降解酶，则底物为pNPP(磷酸对硝基苯基酯)。

16.权利要求1所述的识别DNA突变的方法，其中的颜色变化用肉眼检测。

17.权利要求1所述的识别DNA突变的方法，其中吸光度通过使用一台ELISA读数器进行测量。

18.一种识别DNA突变的试剂盒，其包括：

(i)内部具有胺基的微孔；

(ii)10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亚胺(EDC)，pH7.0，和10mM 1-甲基咪唑，pH7.0；

(iii)0.4M NaOH/0.25％吐温-20溶液；

(iv)含有dH₂O、20×SSPE/0.0167％ Triton X-100和鲑鱼精子DNA(10mg/ml)的溶液；

(v)0.5×SSC/0.1％吐温-20溶液；

(vi)链霉抗生物素-碱性磷酸酶；

(vii)含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液；

(viii)含有150mM NaCl/0.1吐温-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液；

(ix)pNPP(磷酸对硝基苯基酯)。