[发明专利]一种使用微孔识别DNA突变的方法及为此提供的试剂盒

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及一种使用微孔识别DNA突变的方法及为此提供的试剂盒，更具体地说，涉及一种使用微孔、用于识别单碱基突变的经济、简便及安全的方法及为此提供的试剂盒，单碱基突变包括置换、插入和缺失。

发明背景

在该领域中，通过基因识别确定生物的物种以及诊断疾病的技术已广泛采用(请参见《临床微生物学学报》(J.Clin.Microbiol.)，34：130-133，1996)。根据疾病的种类和类型，通过使用多种药物可以治疗疾病。然而，在疾病是由于感染了可能发生突变的微生物所引起的情况下，常规药物的使用就受到了限制。

检测微小突变如DNA序列的置换、插入和缺失的常规技术包括点渍法、RFLP(限制性片段长度多态性)分析、SSCP(单链构象多态性)分析和DNA测序。

首先，点渍技术利用DNA印迹法原理，其中在一特定温度以上，即使一个单碱基对失配也会引起DNA双链体的破坏。点渍法可以通过检测由一个靶序列代表的寡核苷酸探针产生的信号确定突变的存在，当该寡核苷酸探针与固定在膜上的核酸杂交时，预先用连接到显色应答体上的放射性同位素、荧光染料或酶标记(请参见《英国皮肤病学报》(British J.Dermatol.)，131：72-77，1994)。也可以通过将一个寡核苷酸探针固定在膜上，并将一个靶向DNA进行预扩增，由被固定的寡核苷酸和扩增的DNA之间双链体的形成确定突变。

其次，RFLP分析利用了只切割特定序列的限制酶的特性。换句话说，一个被PCR扩增的正常核苷酸序列可以用一种限制酶切割，而识别部位发生突变的相应的核苷酸序列却不能被相同的酶切割。用一种限制酶处理正常的和发生突变的DNA样品后，将所得到的DNA片段的混合物一起在相同的凝胶上进行电泳，可以通过比较每个样品的DNA片段的数目测定突变的存在(请参见《分子细胞生物学》(Mol.CellBiol.)，279-281，1995)。

第三，SSCP分析利用单链DNA的特性，其中其由即使一个单点突变引起的构象的变化引起非变性凝胶中片段迁移的变化。在一种称为SSCP的技术中，当正常DNA以及突变DNA的限制切割方式保持相同时，有时也可能通过序列变化对单链DNA的短片段的迁移的影响检测序列的变化。通过比较非变性凝胶中突变DNA和未突变DNA链的迁移方式，可以确定突变的存在与否(请参见《分子细胞生物学》，289，1995)。

除了上面提到的几种技术外，也可以由通过凝胶电泳或使用仪器进行的直接DNA测序检测突变(请参见《分子细胞生物学》，245-248，1995)。所说的典型包括使用放射性物质、荧光染料或酶检测信号的技术具有一些缺点，如安全问题，并且在使用放射性标记的情况下，处理废物的成本很高，而在不使用放射性标记的情况下，由于使用膜或进行丙烯酰胺凝胶电泳而使操作麻烦并且费时。

同时，也可通过利用识别特异性核苷酸序列的方法，使用已经用于由识别抗体蛋白质，或用于通过与DNA或寡核苷酸杂交识别一种特异核苷酸序列的微孔板来确定突变的存在与否。例如，将一个样品DNA固定到微孔上，然后使用与待识别的正常DNA序列对应的寡核苷酸探针识别：即，将一个通过PCR技术扩增的样品DNA固定到一个微孔上，用一个结合了生物素的探针进行杂交，然后使用一种酶对杂交进行评价(请参见《分子细胞生物学》，6(1)：79-85，1992)。但是，在先技术方法在几个方面被证明不能令人满意：由于在从病人采集样品DNA后，样品DNA必须被固定到微孔上，因此分析样品DNA很费时；由于DNA的长度，由PCR扩增的样品DNA可能还会有抑制与探针杂交的第二结构；长度较长的DNA分子可能会阻止其与孔的结合(请参见《分析生物化学》(Anal.Biochem.)，138-142，1991)；以及，由于使单链变性后一个样品DNA固定到一个微孔上，在实验期间内很容易发生单链DNA的复性，这降低了样品DNA与探针结合的能力。

本发明概述

按照本发明，发现DNA序列突变的识别可以一种经济、简便和安全的方式，通过使用微孔和能够结合到生物素上的降解酶进行。

因此，本发明的一个主要目的是提供一种通过用PCR扩增靶(样品)DNA并使用微孔，识别其相应的正常序列已经被测定的DNA序列的突变的方法。

本发明的另一个目的是由此提供一种方便使用的试剂盒。

附图的简单说明

通过以下的描述并结合附图，本发明的上述及其它目的和特征将变得十分明显，其中：

图1为显示使用本发明方法识别DNA突变的结果的图形。