[发明专利]胡萝卜素羟化酶和制备叶黄素衍生物的方法

说明书

本发明涉及具有将β-胡萝卜素转化成玉米黄质或将角黄素转化成虾青素的酶活性的蛋白，涉及编码这些蛋白的核酸，涉及含有这些核酸的核酸构建体，涉及基因操作改造的生物，其中与野生型相比上述基因操作导致或提高了该核苷酸的基因表达，本发明还涉及制备叶黄素衍生物的方法。

叶黄素是动物，植物或微生物来源的含氧的类胡萝卜素。作为色素底物和维生素A的前体，叶黄素如黄体素(lutein)，玉米黄质或虾青素在人类和牲畜的膳食中是重要的添加物。此外，叶黄素(xanthophyll)具有重要的健康促进作用，如增强免疫应答和，由于它们的抗氧化特性，防癌作用，这使得它们成为感兴趣的营养药。因此，制备叶黄素和叶黄素含量增高的食品的经济方法非常重要。特别是，制备叶黄素的经济方法为生物技术方法，它利用了源自产叶黄素生物的叶黄素生物合成的蛋白和生物合成基因。

催化β-胡萝卜素通过β-隐黄质向玉米黄质酶学转化的原核β-胡萝卜素羟化酶以及编码这些蛋白的基因在细菌夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)Misawa et al.，J.of Bacteriology 1990，6704-6712；EP 393690 B1)，草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)(WO 9113078)，产碱杆菌属(Alcaligenes)sp.PC-1(EP 735 137A1)，产黄菌属(Flavobacteriumsp.)菌株R1534(Pasamontes etal.，Gene 1997，185，35-41；EP 747483 A2)中和在蓝藻(Cyanobacterium)，集胞藻属(Synechocystis)sp.PCC6803(Masamoto et al.，Plant Cell Physiol.1998，39(5)，560-564)中是已知的。

还已知源自橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)，产碱杆菌属(Alcaligenes)和夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的原核β-胡萝卜素羟化酶还能将角黄素通过adonirubin转化成虾青素(Misawa et al.，J.of Bacteriology 1995，6575-6584；Fraseret al.，J.Biol.Chem.1997，272，6128-6135)。

在真核生物来源中，已知三种植物β-胡萝卜素羟化酶能催化β-胡萝卜素通过β-隐黄质向玉米黄质的酶学转化。相应的cDNA已经从拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Cunningham et al，J.Biol.Chem.1996，271，24349-24352，WO 9736998)和从辣椒(Capsicum annuumL.)(Bouvier et al.，Biochimica et Biophysica Acta 1998，1391，320-328)中分离得到。

真核来源的基因比原核基因的优越之处在于它们在高等转基因生物，如植物，中的表达更好。然而，仍然有必要通过对生物整合真核核酸以改善或提高制备叶黄素衍生物或制备叶黄素含量增高的食品的经济方法的叶黄素产量。

此外，在现有技术中适宜的真核β-胡萝卜素羟化酶的缺点在于它们的底物范围很窄，以至于不能被羟化酶转化的代谢产物增加，并且可能对上述羟化酶产生抑制效应。

本发明的一个目标为弥补上述的现有技术中的缺陷，并提供具有改良特性的β-胡萝卜素羟化酶。

我们发现这个目标可以通过一种蛋白达到，该蛋白具有将β-胡萝卜素转化成玉米黄质或将角黄素转化成虾青素的酶学活性，该蛋白含有SEQ ID NO：2中的氨基酸序列，或通过氨基酸的替代，插入或缺失从该序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO：2的序列具有至少50％同源性的序列。

在此后的胡萝卜素羟化酶的意思为根据本发明的的一种蛋白，即，具有将β-胡萝卜素转化成玉米黄质或将角黄素转化成虾青素的酶学活性的蛋白，该蛋白含有SEQ ID NO：2中的氨基酸序列，或通过氨基酸的替代，插入或缺失从该序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO：2的序列在氨基酸水平上具有至少50％同源性的序列。

SEQ ID NO：2中所描述的氨基酸序列是通过SEQ ID NO：1中所描述的cDNA序列的翻译得到的。