[发明专利]α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸的微生物学生产方法

权利要求书

1.用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的微生物学方法，其中，在有有效量的腺苷三磷酸(ATP)存在的条件下，让所述底物与包括通过一个缩合结构域连接的两个最小组件的非核糖体二肽合成酶接触，其中，所述组件的N-末端组件识别L-天冬氨酸，而所述组件的C-末端组件识别L-苯丙氨酸，并且，其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述每一个最小组件由一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子组成，并回收所形成的Asp-Phe。

2.如权利要求1的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述二肽合成酶上的缩合结构域以如下方式与两个最小组件连接：它还能与识别L-天冬氨酸的组件共价结合。

3.如权利要求1或2的生产Asp-Phe的方法，其特征在于还存在一种用于释放在所述二肽合成酶上所形成的Asp-Phe的释放因子。

4.如权利要求1-3中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述释放因子是一种蛋白，该蛋白具有硫酯酶样功能，并且在其C-末端构成所述二肽合成酶的整合的结构域。

5.如权利要求1-4中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于在生产Asp-Phe之前，所述二肽合成酶业已用一种或多种翻译后修饰活性对其功能进行了优化。

6.如权利要求5的生产Asp-Phe的方法，其特征在于使用4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4’-PP)转移酶作为翻译后修饰活性。

7.如权利要求1-6中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于还有一种具有II型硫酯酶样活性的非整合蛋白与所述二肽合成酶同时存在。

8.如权利要求1-7中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述二肽合成酶存在于微生物的活的细胞材料中，将葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe添加到所述发酵罐中，并且回收所形成的Asp-Phe。

9.如权利要求8的生产Asp-Phe的方法，其特征在于在Asp-Phe二肽合成酶开始表达之前，首先让所述微生物在一种发酵罐中生长到预定的细胞密度，并添加葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe以便启动Asp-Phe二肽的合成。

10.如权利要求9的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述微生物是能产生L-苯丙氨酸的微生物，并且仅添加葡萄糖和L-Asp。

11.如权利要求10的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述微生物是埃希氏菌或芽孢杆菌。

12.如权利要求8-11中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所使用的微生物是具有针对Asp-Phe的减弱了的蛋白酶活性的或者缺乏针对Asp-Phe的活性的菌株。

13.如权利要求8-12中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所使用的微生物还含有一种用于输出所形成的Asp-Phe的合适的输出系统和/或一种或多种用于吸收葡萄糖和/或L-Asp和/或L-Phe的合适的吸收系统。

14.如权利要求1-7中任一项的生产Asp-Phe的方法，其特征在于Asp-Phe的生产是在酶反应器中体外进行的，同时补充ATP并添加L-Asp和/或L-Phe，并回收所形成的Asp-Phe。

15.如权利要求14的生产Asp-Phe的方法，其特征在于ATP的补充其一部分是由原位ATP-再生系统提供的。

16.如权利要求15的生产Asp-Phe的方法，其特征在于所述ATP再生系统存在于透化微生物中。

17.一种编码非核糖体Asp-Phe二肽合成酶的DNA片段或DNA片段的组合，所述合成酶包括两个通过一个缩合结构域连接的最小组件，其中，所述组件中N-末端组件能识别L-天冬氨酸，而所述组件中的C-末端组件能识别L-苯丙氨酸，并且其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述最小组件中的每一个包括一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子。