[发明专利]α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸的微生物学生产方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的新型微生物学方法。本发明还涉及编码一种新型Asp-Phe二肽合成酶的新型DNA片段或DNA片段的组合，含有所述DNA片段的微生物，以及所述新型Asp-Phe二肽合成酶本身。

发明背景

α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(以下又称之为Asp-Phe)是一种重要的二肽，特别是被用于生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(以下又称之为APM)。已知APM是一种高强度人工增甜剂，其甜度大约为蔗糖甜度的200倍。β-形式的APM立体异构体(其中，一个或两个氨基酸为D-构型)不具有甜度特征。APM被用于对各种食用材料进行增甜。

现有各种APM生产方法；现有的方法可以划分为化学和生物化学/微生物学(特别是酶学)方法。在用已知的肽合成技术生产APM的方法中，为了实现选择性的α-L，L-连接，必须进行繁琐的、并且代价昂贵的工艺，包括对α-氨基、羧基和侧链基团进行强化保护和脱保护。另一方面，发酵方法通常是廉价的，并且，它本身具有对映体-和区域选择性。因此，发酵方法一直被认为是上述化学和生物化学合成方法的有希望的替代方法。通过EP-A-0036258可以看出，到目前为止，一直认为不适合将二肽Asp-Phe作为微生物自身蛋白生产过程的一部分在微生物中生产；理论上讲，通过将核苷酸碱基序列GAC或GAT(已知是L-Asp的密码子)和TTT或TTC(已知为L-Phe密码子)插入微生物的DNA中可以实现所述生产，将所述碱基序列插入正确的读框中，在其前面和后面有合适的加工或终止密码子，并且受到合适的控制。因此，在EP-A-0036258中，尝试了通过预先生产结构式(Asp-Phe)n的蛋白片段间接合成Asp-Phe，其中，n是一个大的数字；这一目的是通过在一种克隆载体中插入编码所述聚-(Asp-Phe)蛋白的合成DNA-片段而实现的。不过，所述核糖体发酵方法仍然繁琐，并且在经济上也没有吸引力。主要问题在于从所述多肽中回收Asp-Phe二肽。类似地缺陷可归因于由Choi，S.Y.等所披露的一种方法，参见J.Microbiol.Biotechnol.，2，1992，1-6页，其中，合成了一种含有Asp-Phe-Lsy的三肽序列的片段的多肽。因此，仍然存在寻找Asp-Phe的直接发酵方法的必要性。到目前为止尚不了解Asp-Phe的直接发酵。

发明详述生产Asp-Phe的方法：

令人吃惊的是，本发明人现在发现了一种用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的新型的、有希望的替代的微生物学方法，其中，在有有效量的腺苷三磷酸(ATP)存在的条件下，让所述底物与包括通过一个缩合结构域连接的两个最小组件的非核糖体二肽合成酶接触，其中，所述组件的N-末端组件识别L-天冬氨酸，而所述组件的C-末端组件识别L-苯丙氨酸，并且，其N-末端与所述缩合结构域共价结合，其中，所述每一个最小组件由一个腺苷酸化结构域和一个含有硫醇化结构域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅助因子组成，并回收所形成的Asp-Phe。

因此，这种新方法提供了一种直接发酵Asp-Phe的微生物学方法，随后通过一个甲基化步骤可将其转化成高效增甜剂天冬苯丙二肽酯。到目前为止，通过直接发酵生产Asp-Phe的方法与这种二肽的非核糖体合成方法一样是未知的。因此，本发明人提供了一种生产二肽Asp-Phe的直接微生物学方法，不需要任何保护和脱保护步骤。