[发明专利]位点专一性同位素标记的蛋白质、氨基酸、及其生物化学前体

说明书

                     发明领域

本发明介绍位点专一性同位素标记的有机化合物及其制备方法。更具体而言，本发明涉及位点专一性同位素标记的亮氨酸、异亮氨酸，和缬氨酸的生物化学前体、所述同位素标记的氨基酸本身，及由其制成的蛋白质、蛋白片段或多肽，以及有关的制备方法。

                      发明背景

近来发展起来的探索新药物的技术，将核磁共振(NMR)谱学用来发现与特别的靶分子结合的化合物，这种靶分子例如为蛋白质(参见例如Fesik等的美国专利No.5,698,401和5,804,390)。该技术包括测定蛋白的第一个二维¹⁵N/¹H NMR相关光谱，该蛋白的氮原子位点富含同位素¹⁵N。此蛋白的第一相关光谱是在没有任何可能是配体化合物的情况下测得的。然后，将有可能是配体的化合物，或此类假定为配体化合物的混合物与富含同位素氮的蛋白混合，得到第二个NMR相关光谱。比较这两种光谱，由该两种光谱间的差别可得到以下有关资料：1)任何配体与主体蛋白间的结合是否存在，2)该结合的位点(一个或多个)，以及3)该结合的强度。

上述Fesik等描述的技术中，采用了靶分子，该靶分子富含NMR可检测的同位素¹⁵N自旋原子核。这种方法依赖于将适合的微生物进行遗传修饰，以表达所需要的蛋白质、蛋白片段，或多肽，然后将此修饰后的微生物在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基上培养，该氮源包括¹⁵N标记的营养物。较便宜的市售¹⁵N铵盐可提供此¹⁵N源。

但是，这种NMR药物探索技术，在用于富含同位素¹³C的靶分子时，却受到二个缺点的限制。第一，要生产出有效量的富含¹³C的靶分子是比较昂贵的。例如，用遗传修饰的微生物，在含有市售均匀标记的葡萄糖(葡萄糖-¹³C₆)营养培养基上生长，来生产蛋白质成本很高。在递交本申请时，葡萄糖-¹³C₆的价格大约为$480/g。另一种生产¹³C-标记的蛋白质的方法，是营养培养基中包含¹³C-均匀标记的氨基酸，同样也是昂贵的。第二，用葡萄糖-¹³C₆或市售的均匀富含¹³C的氨基酸所生产的生物分子，用于NMR相关光谱技术并不理想。微生物在含有均匀富含¹³C原料的营养培养基上生长时，它所表达的生物分子含有与其邻近的¹³C-标记碳原子。因为NMR技术是建立在探测空间自旋偶合(亦即核极化效应)的基础上的，邻近的¹³C原子核的较强自旋-自旋偶合干扰了所要观察的结果。因此，需要开发位点专一性的富含¹³C的氨基酸、蛋白质和多肽。

                      发明概述

本发明提供位点专一性富含同位素的氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸的生物化学前体，以及位点专一性富含同位素的氨基酸本身。此外，还提供含有位点专一性富含同位素的氨酰基残基的蛋白质、蛋白片段和多肽，以及它们的生产方法，该氨酰基残基来源于上述位点专一富含同位素的氨基酸。该氨基酸及其生物合成前体中，在离其羧基最远的甲基碳原子上，富含同位素¹³C或¹⁴C。在本发明的标记氨基酸中，不存在相邻碳原子被标记的情况。在标记物为¹³C的情况下，本发明的氨基酸能理想地用于NMR药物探测技术，因为不出现相邻碳原子的¹³C-¹³C自旋-自旋相互作用而干扰所需要的信号。而且，因为仅在该氨基酸的甲基碳原子上标记，该甲基上，三个磁性相同的氢原子提供很强NMR信号，用以观察这些氧原子与其相连的¹³C原子间任何偶合效应。