[发明专利]GCSF缀合物

说明书

发明背景

粒细胞集落刺激因子(GCSF)是一种药学上的活性蛋白，所述蛋白调节嗜中性粒细胞的增殖、分化和机能的激活(Metcalf，Blood 67：257(1986)；Yan等，Blood 84(3)：795-799(1994)；Bensinger等，Blood 81(11)：3158-3163(1993)；Roberts等，Expt’l Hematology 22：1156-1163(1994)；Neben等，Blood 81(7)：1960-1967(1993))。GCSF可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移(mobilization)，并且用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞减少的患者，或用作骨髓移植的前序。

美国专利第5,214,132号公开了一种人GCSF的突变蛋白，所述突变蛋白在位置1、3、4、5和17不同于天然hGCSF，所述突变蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser。(也参见，Kuga等，Biochem.Biophys.Res.Commun.159：103-111(1989))。M.Okabe等(Blood 75(9)：1788-1793(1990年5月1日))报道了一种rhGCSF的衍生物，其中在rhGCSF N端区的5个位置上的氨基酸被取代，在两种测定中，所述rhGCSF衍生物显示比小鼠和/或人骨髓祖细胞中的完整rhGCSF的比活高。美国专利第5,218,092号公开了一种人GCSF的突变蛋白，所述突变蛋白在位置1、3、4、5、17、145和147不同于天然hGCSF，所述突变蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、Asn和Ser。美国专利第5,214,132和5,218,092号的公开内容通过引用结合到本文中。

蛋白治疗药物例如GCSF的生物利用度通常受血浆半寿期短的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。其它治疗蛋白的研究已经表明，通过使蛋白与聚合物例如聚乙二醇(PEG)缀合，通常一个与通过蛋白和PEG两者共价结合的连接部分缀合，可以克服这样的困难。

这种PEG缀合的生物分子已经显示具有临床上的可应用特性(Inada等，J.Bioact.and Compatible Polymers，5：343(1990)；Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，9：249(1992)；和Katre，Advanced Drug Delivery Systems，10：91(1993))。在这些特性中有更好的物理和热稳定性、针对酶降解敏感性的保护作用、溶解度增加、使体内循环半寿期更长和清除率减少、降低免疫原性和抗原性以及降低毒性。

具有与本发明缀合物的结构不同的PEG-GCSF缀合物公开于欧洲专利公布号EP 0 335 423；欧洲专利公布号EP 0 401 384；R.W.Niven等，J.Controlled Release 32：177-189(1994)；和Satake-Ishikawa等，Cell Structure and Function，17：157-160(1992))。

发明概述

因此，本发明是一类新型的GCSF的PEG衍生物。本发明的缀合物具有一个可以参见下文的酰胺连接物。

与未修饰的GCSF(即没有连接PEG的GCSF)比较，本缀合物的循环半寿期和血浆滞留期增加、清除率减少以及体内粒细胞生成活性增加。另外，与PEG-GCSF缀合物比较，本发明的缀合物具有优良的粒细胞生成特性。其它PEG-GCSF缀合物公开于欧洲专利公布号EP 0335 423；欧洲专利公布号EP 0 401 384；以及载于Niven等(出处同上)中。然而，本发明缀合物的结构不同于这些缀合物，并且具有优良的特性，尤其在体内低剂量时表现出长期、高粒细胞生成活性。

本发明的一个优选的GCSF是一种GCSF突变蛋白，所述突变蛋白的特性等同于或优于天然GCSF，并且与GCSF的用途相同。所述突变蛋白与GCSF的氨基酸序列相同，只是所述突变蛋白在位置1、3、4、5和17的氨基酸不是天然GCSF氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser(GCSF突变蛋白)(参见图1)。该突变蛋白公开于美国专利第5,214,132号，该专利通过引用结合到本文中。

本发明生理学活性PEG-GCSF缀合物的结构式如下：