[发明专利]膜内在蛋白质的抽提

权利要求书

1.一种通过不同去污剂切向流渗滤，从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然或重组表达的革兰阴性菌内膜蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；

(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂防止蛋白质水解；

(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并取出内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，防止它们溶解；和

(d)收集(c)步取得的内膜蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)步的裂解发生在微流化器中；在(b)步中，缓冲液选自Hepes、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、Tris^TM、磷酸钠和硼酸钠；在(c)步中，缓冲液选自Hepes、MOPS、Tris^TM、磷酸钠和硼酸钠，去污剂选自Zwittergent^TM化合物、非离子性Triton^TM化合物、十二烷基肌氨酸钠、葡糖苷化合物、胆酸盐化合物和十二烷基麦芽苷，二价阳离子选自Mg²⁺和Ca²⁺。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在(b)步中，缓冲液是Hepes，螯合剂是EDTA；在(c)步中，缓冲液是Hepes，去污剂是Triton^TM X-100，二价阳离子是Mg²⁺。

4.一种通过不同去污剂切向流渗滤，从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然或重组表达的革兰阴性菌外膜蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；

(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂防止蛋白质水解；

(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，防止它们溶解；

(d)用(c)步的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，并且使用(c)步不含去污剂的二价阳离子，以降低(c)步的去污剂浓度；

(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，并用螯合剂和去污剂溶解和取出外膜蛋白质；

(f)收集(e)步取得的外膜蛋白质。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，(a)的裂解发生在微流化器中；在(b)步中，缓冲液选自Hepes、MOPS、Tris^TM、磷酸钠和硼酸钠；在(c)步中，缓冲液选自Hepes、MOPS、Tris^TM、磷酸钠和硼酸钠，去污剂选自Zwittergent^TM化合物、非离子性Triton^TM化合物、十二烷基肌氨酸钠、葡糖苷化合物、胆酸盐化合物和十二烷基麦芽苷，二价阳离子选自Mg²⁺和Ca²⁺；在(d)步中，缓冲液选自Hepes、MOPS、Tris^TM、磷酸钠和硼酸钠，二价阳离子选自Mg²⁺和Ca²⁺；在(e)步中，缓冲液选自Hepes、MOPS、Tris^TM、磷酸钠和硼酸钠，去污剂选自Zwittergent^TM化合物、非离子性Triton^TM化合物、十二烷基肌氨酸钠、葡糖苷化合物、胆酸盐化合物和十二烷基麦芽苷。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在(b)步中，缓冲液是Hepes，螯合剂是EDTA；在(c)步中，缓冲液是Hepes，去污剂是Triton^TM X-100，二价阳离子是Mg²⁺；在(d)步中，缓冲液是Hepes，二价阳离子是Mg²⁺；在(e)步中，缓冲液是Tris^TM，螯合剂是EDTA，去污剂是Zwittergent^TM 3-12。