[发明专利]膜内在蛋白质的抽提

说明书

                          技术领域

本发明涉及采用不同去污剂切向流过渗滤法，从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提革兰阴性菌膜内在蛋白质的方法。

                          背景技术

革兰阴性菌有内膜和外膜。这些膜中所含的蛋白质总体上称为膜内在蛋白质。可从革兰阴性菌中抽提获得相对少量的天然膜内在蛋白质。重组表达技术能使细菌增加表达这些蛋白质。

小规模批量纯化这些天然的或重组的膜内在蛋白质涉及一利用离心从细菌细胞裂解液中抽提蛋白质的抽提步骤，接着采用常规的技术进行下游纯化。

然而，离心不适用于大规模地抽提这些蛋白质，因为离心是个麻烦的过程。需要一种大规模的抽提方法，以获得足够用于经济生产的大量蛋白质。

因而，需要一种避免使用离心从而更适用于大规模生产的抽提天然或重组革兰阴性菌膜内在蛋白质的方法。两种这样的蛋白质是流感嗜血杆菌的脂化的外膜蛋白质P4和P6。

                     发明概述

因而，本发明的一个目的是发展一种避免使用离心并且更适用于大规模生产的抽提天然或重组革兰阴性菌膜内在蛋白质的方法。

本发明的另一目的是发展一种选择性地溶解革兰阴性菌的内膜和外膜蛋白质的方法。

本发明的又一目的是发展从大肠杆菌抽提脂化形式的重组流感嗜血杆菌外膜蛋白质P4和P6的方法。

通过采用不同去污剂切向流渗滤且避免离心的方法实现本发明下述这些和其它目的。还可采用这些方法连续抽提所需的蛋白质。

对于采用不同去污剂切向流渗滤，分别从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然的或重组表达的革兰阴性菌内膜蛋白质的方法，它包括：

(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；

(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂防止蛋白质水解；

(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并取出内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，防止它们溶解；和

(d)收集(c)步取得的内膜蛋白质。

对于采用不同去污剂切向流渗滤，分别从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然的或重组表达的革兰阴性菌外膜蛋白质的方法，它包括：

(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；

(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，使用螯合剂防止蛋白质水解；

(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们溶解；

(d)用(c)步的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，并且用不含去污剂的(c)步的二价阳离子，以降低(c)步的去污剂浓度；

(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，并用螯合剂和去污剂溶解和取出外膜蛋白质；

(f)收集(e)步取得的外膜蛋白质。

如果需要，在上述步骤之后，可进一步进行以下抽提步骤：

(g)使用(e)步中除去污剂以外的其余试剂渗滤从(e)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；

(h)用(e)步试剂渗滤从(g)得到的裂解产物；和

(i)收集(h)步取得的外膜蛋白质。

对于采用不同去污剂切向流渗滤，从细菌宿主细胞中抽提出流感嗜血杆菌脂化重组外膜蛋白质P4(脂化rP4)的方法，它包括：

(a)裂解发酵培养液中的细菌宿主细胞；

(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂以防止蛋白质水解；

(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们的溶解；

(d)用(c)步的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，并且使用不含去污剂的(c)步的二价阳离子，以降低(c)带来的去污剂浓度；

(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，用螯合剂和去污剂溶解外膜蛋白质；