[发明专利]通过提高细胞NADPH生产L－氨基酸的方法

说明书

                  发明背景

发明领域

概括的说，本发明涉及L-氨基酸的生产方法和磷酸葡糖异构酶(phosphoglucoisomerase)的编码基因。

背景资料

工业上使用细菌细胞通过发酵方法来生产氨基酸(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991；S.Kinoshita、K.Nakayama、和S.Nagasaki，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)4：128-129，1958)。虽然许多研究报告和评论已经开始关注发酵方法和氨基酸的积累机制，但是需要开发更多的方法来提高微生物的氨基酸产量(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991；K.Aida等人编，《氨基酸生产中的生物技术》(Biotechnology ofAmino Acid Production)，Kodansha(东京)/Elsevier(纽约)，1986；和A.Marx等人，代谢工程(Metabolic Engineering)1：35-48，1999)。

在通过代谢工程来引导葡萄糖衍生碳向芳香族氨基酸结构的流动中已经取得了一些成功(N.Flores等人，自然生物技术(NatureBiotechnol.)14：620-623，1996)。但是，还没有在生产者菌株中成功应用的记录(A.Berry，TIBTECH 14：250-256，1996)。

代谢工程涉及对发酵过程中流经各种代谢途径的起始材料(诸如碳水化合物和有机酸)的碳流的操作。例如，已经使用¹³C-NMR进行了关于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中心代谢的研究(S.Ishino等人，普通和应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37：157-165，1991；和A.Marx等人，生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)49：111-129，1996)。另外，使用¹³C-NMR，Walker等人(T.Walker等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)257：1189-1195，1982)通过嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)分析了谷氨酸发酵，Inbar等人通过黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(L.Inbar等人，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)149：601-607，1985)研究了赖氨酸发酵。

本发明通过代谢工程解决了提高发酵过程中氨基酸产量的问题。

                         发明概述

本发明提供了L-氨基酸的生产方法，包括培养与未改变细菌细胞相比NADPH量增加的经改变细菌细胞，因而来自所述经改变细菌细胞的L-氨基酸产量高于来自未改变细菌细胞的产量。

本发明提供了用于生成具有突变型磷酸葡糖异构酶(pgi)基因的细菌细胞的方法，包括(a)将pgi基因的内部区域亚克隆到自杀载体中，并(b)通过同源重组将所述自杀载体插入细菌基因组，由此生成具有突变型pgi基因的细菌细胞。本发明还提供了按照该方法生成的经改变细菌细胞。

本发明还提供了可用于该方法的载体。

本发明还提供了包含谷氨酸棒杆菌磷酸葡糖异构酶多肽的编码多核苷酸的分离核酸分子，该多肽具有图1(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列或由存在于细菌宿主(NRRL保藏物编号B-30174，1999年8月17日)中的DNA克隆编码的氨基酸序列。

本发明还涉及包含本发明分离核酸分子的重组载体、包含该重组载体的宿主细胞、生成这种载体和宿主细胞的方法、以及通过重组技术将它们用于生产Pgi多肽或肽的方法。

本发明还提供了具有由本文所述多核苷酸编码的氨基酸序列的分离Pgi肽。

根据下文的描述将明确本发明的其它优势。

                        图的简述

图1A-1C显示了pgi的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。Pgi肽的推导分子量为大约59kDa。

                        发明详述