[发明专利]用于测定全血中的凝固因子活性的方法

说明书

本发明得到了美国国立卫生研究院(NIH)的资助，合同号HL48872。美国政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明一般性地涉及医学诊断学和疾病预防领域。更具体地，通过使用全血样品、在存在和不存在前凝血质或抗凝血质的至少一种抑制剂的情况下，测定血液凝块形成的速率，本发明涉及用于快速评估血液凝固活性的诊断方法和测试试剂盒。个体血液样品中的凝固活性以及不同样品间的活性差异，指示了某些病理状态的存在或潜在发展。

背景技术

血液过快形成凝块，这种倾向性在预见若干严重病理状态的发生、发展和恢复中很重要。这些疾病或者直接产生于凝块形成的过程，或者受该过程的调节。这些疾病的例子包括心脏病发作、中风、冠状动脉疾病、深静脉血栓形成和肺栓塞等。在这些疾病中，冠状动脉疾病在美国是头号杀手。

此外，某些临床状态，诸如血管疾病、外科手术、创伤、恶性肿瘤、血管修复装置、全身麻醉、怀孕、服用口服避孕药、系统性红斑狼疮以及感染，可能使个体易于发生反向的凝块形成现象。由血液凝块形成异常而导致的可疑急性状态的患者，在急症室就诊。一种采用全血样品来快速测定患者当前形成血凝块危险性的方法，将有助于确定或排除血栓形成过程和凝血病。这不仅有利于将急诊健康治疗提供给那些有需要的人，同时还能够早期识别那些有可能发生潜在的致命性血液凝固病理的患者。

血液也可能形成凝块过慢或者根本不形成凝块，这种情况会导致出血或其他血液凝固障碍。血友病就是遗传性的出血疾病例子。另外，影响肝脏的疾病，诸如酒精性肝硬变以及急性和慢性肝炎，都与多种凝块形成异常相关，这是因为肝脏是合成多种凝固因子的器官。

在遗传性的凝固障碍中，已知最多的是血友病A和B，它们分别与因子VIII和IX的活性下降相关。这种障碍的严重程度，取决于相应的凝块形成因子的减少程度。严重的病例在生命的早期就已经表现出来，并且患血友病的儿童常常表现出大关节诸如膝盖容易出血以及凝块形成的显著缺陷。较轻微的血友病也许直到生命的晚期才明显表现出来。

血友病的治疗一般包括输入血液制品的浓缩剂，其中含有大量的凝固因子VIII或IX。虽然许多血友病患者能够过一种相对正常的生活，但是在进行户外活动以及在外科手术或牙病治疗期间却必须格外小心。不幸的是，10％的血友病患者人群产生了因子VIII抗体并变得难以治疗。

血液过快形成凝块(即凝固性太高)也是一种病理状态。弥散性血管内凝血(DIC)就是获得性血液凝固障碍的一个例子，其特征在于血液病理性地快速形成凝块。

血液形成凝块是一个复杂的过程；它涉及多种起始因子，以及激活剂、酶和调节剂的多级联系统，最终导致纤维蛋白的形成，纤维蛋白又聚合为不溶性的凝块。内源性和外源性的血液凝固途径，在例如Davie等人，血液凝固级联系统：起始、维持和调节，生物化学(Biochemistry)，30(43)：10363-70(1991)中有描述，此处引用作为参考。

确定血液凝块形成倾向的经典方法，是通过手工或自动化地测定血浆或血液样品形成不溶性的纤维蛋白丝或者凝块所需的时间。例如，凝块形成的检测，可以采用肉眼观察纤维蛋白丝的形成，或者采用自动化的方法诸如检测粘度的变化一粘度可通过机械或电阻抗来测定，或者采用光学检测。

对所抽取的没有加入抗凝血质的新鲜血液，可以立即进行凝固时间的测定。或者，也可以用含有结合钙离子的抗凝血质诸如柠檬酸盐的血液，测定凝固时间。在这种情况下，凝固时间的测定，是通过加入钙盐以逆转抗凝血质的效应而起始的。后一种测定方法所得到的时间被称为再钙化时间。通常所使用的测定血液凝固时间的典型方法，包括依赖于凝血酶原时间(PT)的测定、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的测定、凝血酶时间的测定以及纤维蛋白原水平的测定这样一些方法。也可以通过测定循环血液中可溶性纤维蛋白或纤维蛋白降解产物的水平，对血栓形成过程进行检测。

血液凝固时间的确定，最常用于疾病诸如血友病、冯威勒布兰特病、B型血友病以及某些肝脏疾病的诊断，在这些疾病中，异常延长的凝固时间一般具有诊断价值。虽然有许多疾病均涉及到异常快速的血液凝固，但是当前的测定方法，在鉴定所有这些快速形成凝块病理状态时，除了那些最异常的情况之外，并没有足够敏感到具有诊断价值。