[发明专利]突变型Tn5转座酶及其使用方法

说明书

与相关申请的相互参照：

本申请要求享有1999年8月2日递交的美国临时专利申请No.60/146,686的优先权，本文将其全部纳入作为参考。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本发明的完成使用了联邦政府的资金NIH，Grant No.GM 50692。因此联邦政府享有本发明的某些权利。

发明背景

通过维持低的移动水平，细菌转座子如Tn5在细胞内进化。当需要该转座子来存活时，这种低的移动水平就阻碍了研究者对分子转座过程的详尽了解和对转座过程用途(如开发新型诊断和治疗的药源)的开发。Tn5是IS4家族的保守性“剪贴”转座子(Rezsohazy，R.，Hallet，B.，Delcour，J.，和Mahillon，J，“插入序列的IS4家族：保守性转座酶基序的证据”，Mol Microbiol.9：1283-1295(1993))，其编码负责它移动的一种53kD转座酶蛋白质(Tnp)。野生型Tn5转座酶的氨基酸和核酸的序列是已知的。Ahmed，A.和Podemski，L.“T5的修正序列”Gene154(1)，129-130(1995)，本文将其全部纳入作为参考。本文附有编码野生型Tn5转座酶的核酸序列，即SEQ ID NO：1。还附有SEQ ID NO：1编码的相应于野生型Tn5转座酶的多肽序列，即SEQ ID NO：2。

Tnp蛋白质促进了该整个元件的移动是通过先与两个19bp特异性结合序列(称为外末端)(OE；SEQ ID NO：3)之一结合，然后形成核蛋白结构(称为突触)，各端平头切割，与靶DNA相连，以及随后的链转移(Reznikoff，W.S.，Bhasin，A.，Davies，D.R.，Goryshin，I.Y.，Mahnke，L.A.，Naumann，T.，Rayment，I.，Steiniger-White，M，和Twining，S.S.，“Tn5：转座的分子窗口”，Biochem.Biophys.Res.Commun.266：729-34(1999))。Tn5转座酶通过联用OE和内末端(IE；SEQ ID NO：4)序列，还可以促进单个插入序列的移动。IE的长度也是19bp，与OE在19个位置中有12个相同(图1)。体内，Tn5转座酶表现出对大肠杆菌的OE明显偏爱。通过存在2个dam甲基化位点(GATC回文序列)，即在每个内末端序列加入4个甲基(IE^ME；也如SEQ ID NO：4所示，未显示甲基化)，抑制了大肠杆菌内转座酶的识别和与IE的结合(Yin，J.C.P.Krebs，M.P.，和Reznikoff，W.S.，“dam甲基化对Tn5转座的影响”，J.Mol.Biol.，199：35-45(1988)，本文将其全部纳入作为参考)。这种甲基化通过减少蛋白质-DAN最初的识别，降低了转座(Jilk，R.A.，York，D.，和Reznikoff，W.S.，“转座酶Tn5外末端的组成”，J.Bacteriol.178：1671-1679(1996))。

要了解Tn5如何转座的主要障碍是纯化的野生型Tnp在体外没有可检测得到的活性。最近，开发了一种转座酶的双突变高活性形式(“Tnp EK/LP”)，其能促进体外转座反应的所有步骤。Tnp EK/LP蛋白质与野生型Tn5 Tnp的不同之处在于54位(Glu突变为Lys)和372位(Leu突变为Pro)，另外在56位的非本质但有益的变化防止了所谓抑制蛋白的产生。这种修饰的高活性Tnp蛋白质保留了对野生型Tn5转座酶OE端(或类OE)的明显偏爱。Tnp EK/LP澄清了先前体内未充分探究的Tn5转座的许多方面问题。

体外，多核苷酸转座是一种将随机突变或靶突变引入基因组的强有效工具。美国专利No.5,925,545和国际出版物No.WO 00/17343公开了有用的基于Tn5转座的体外转座系统，本文将这两者全部纳入作为参考。

需要具有能识别IE和OE的能力且偏爱结合IE的Tnp蛋白质，使我们能够指导核酸的转座，和有助于更复杂的(与用对OE单一特异性的Tnp相比)转座和基因工程策略(上述专利和应用中所述的)。也需要对IE^ME偏爱性提高的Tnp，因为在普通dam+细菌宿主中DNA的甲基化抑制已有Tn5转座酶的结合并降低已有转座酶促进IE限定转座子移动的能力。

发明概述