[发明专利]蛋白质生产

说明书

本发明涉及用于在细菌宿主细胞中重组生产具有明确均一N端的预期异源多肽的方法，包括首先在宿主细胞中以胞质包涵体的形式形成包含具有瘟病毒自我蛋白酶(autoprotease)N^pro自我蛋白酶解活性的肽与异源多肽的融合蛋白，然后分离并处理包涵体，从而通过N^pro自我蛋白酶解活性切割融合蛋白获得预期异源多肽。

在异源生物体中生产重组蛋白时，诸如在细菌细胞中表达人或其它真核生物蛋白时，通常难以获得尽可能接近100％均一的明确N端。本发明具体应用于在许多情况中氨基酸序列应当与人/动物中天然发生的氨基酸序列相同的重组药用蛋白质。

例如在人体中天然表达后，使用中的许多药用蛋白质被转运至胞外空间，并为此目的切除蛋白质前体中存在的信号序列，产生明确N端。由于各种原因，并不总是能够容易的产生这种均一N端，例如在细菌细胞中时。

对于工业规模生产，许多药用蛋白质是在细菌细胞(例如大肠杆菌)的胞质中生产的，因为它们可能在此积累至足够量，而且常常形成不溶性包涵体(IB)，包涵体在加工和纯化中具有极大优势。另外，以包涵体形式表达的蛋白质受到保护免受胞内蛋白酶的降解(R.Rudolph，在《蛋白质工程：原理和实践》一书中，JeffreyL.Cleland和Charles S.Craik编，John Wiley&Sons公司，1995，ISBN0-471-10354-3)。

然而，包涵体物质的生产需要表达的蛋白质在体外重折叠。在许多情况中，这可以通过本身已知的方法来实现(R.Rudolph等人，1996，在《蛋白质功能：实践方法》一书中，T.E.Creighton编，第1-39页)。为此，在还原条件下加入强变性剂以溶解包涵体形式的蛋白质，然后复性。

只有在很少情况中，借助合适的原核或真核信号序列，将表达的蛋白质输出至细菌周质，由于细菌输出机制的转运能力低，此处通常可能只积累很小量的产物。

然而，细菌胞质与真核细胞胞外空间显著不同。一方面，那里存在还原条件；另一方面，那里没有切除N端前导序列而形成成熟蛋白质的机制。所有胞质蛋白质的合成都是由甲硫氨酸起始的，它是由适当起始密码子(ATG＝翻译起点)确定的。在许多蛋白质中保留了这种N端甲硫氨酸；而在其它蛋白质中，由胞质中存在的宿主内在甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切除。切除效率主要取决于两个参数：1.下一个氨基酸的本性，和2.N端在蛋白质三维结构中的定位。当下一个氨基酸是丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、或缬氨酸时，且当N端暴露(即不是“隐藏”在蛋白质内部)时，优选删除N端甲硫氨酸。当下一个氨基酸是其它氨基酸时，特别是带电荷的氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、或精氨酸)，或者当N端位于蛋白质内部时，在大多数情况中，不切除N端甲硫氨酸(Knippers，Rolf，1995，《分子遗传学》，第6版，Georg Thieme Verlag.Stuttgart，纽约，ISBN 3-13-103916-7)。

甚至当第2位氨基酸可促进切割时，切割也很少是完全的。通常会有可观的比例(1-50％)保持不受MAP的影响。

在使用细菌细胞生产重组药用蛋白质的早期，流程只是将编码甲硫氨酸的ATG起始密码子置于成熟(即不含信号序列或其它N端延伸)蛋白质开放读码框(ORF)的前面。表达的蛋白质因而具有序列H₂N-Met-靶蛋白。

只有在少数情况中，有可能实现宿主内在MAP完全切除N端甲硫氨酸。因此，以这种方式生成的大多数蛋白质，或是就其N端而言不均一(Met形式与无Met形式的混合物)，或是它们在N端都具有额外的外来氨基酸(Met)(只有Met形式)。

然而，在许多情况中，这种不均一性或不同于天然序列是不能接受的，因为这些产物常常显示不同的免疫学(例如诱导抗体形成)和药理学(半寿期、药代动力学)特性。由于这些原因，现在在大多数情况中有必要生成性质相同的产物(N端均一且不含外来氨基酸)。在胞质表达的情况中，在大多数情况中本发明的补救方法是将特定内肽酶(例如因子Xa、肠激酶、KEX内肽酶、IgA蛋白酶)或氨肽酶(例如二肽基氨肽酶)的切割序列(前导序列)融合在靶蛋白的N端。然而，这就使得在产物的进一步加工(所谓的下游加工)过程中必需进行额外步骤，包括费用和材料的支出。另外，当存在包涵体时，在许多情况中前导序列将干扰甚至完全阻止重折叠。