[发明专利]细胞材料的絮凝化

说明书

本发明涉及细胞材料从悬浮介质中絮凝化的方法。通常希望将细胞材料(如细胞和/或细胞碎片)从含有细胞材料的液体悬浮培养基中分离出来，一种方法是将细胞材料絮凝化以致于形成的絮凝物可以从液体悬浮培养基中分离出来，分离出来后细胞材料本身仍可以使用。此外可以弃去细胞材料，而使用悬浮培养基中的内含物。

然而已经证实难以找到能够在悬浮介质中给予足够絮凝化作用的絮凝化体系，通常从该悬浮介质中必须分离出细胞材料。特别是经常需要从复杂的介质如生长培养基中分离细胞材料。已经发现使用标准絮凝剂如聚合物进行絮凝化在这些环境中尚有问题。

Sitkey等人在Biotechnology Techniques，6卷，1期，49-52(1992)描述了从发酵肉汤中除去细胞、固体和胶体的方法，分离的目的是回收悬浮培养基中存在的胞外酶。描述了用作絮凝剂的16种聚合物材料。所使用的絮凝剂类型是弱阳离子、中性阳离子、强阳离子、弱阴离子、中性阴离子和非离子的。然而根据作者所述只有两种聚合物能得到有效的澄清，即中性阴离子聚合物Sedipur T1和Sedipur TF5，购于BASF公司。也描述了加入各种阳离子和非离子聚合物，每种都以单一剂量加入作为唯一的絮凝剂，但并没有有效地澄清发酵肉汤。

Mukhopadhyay等人在Biotechnology Techniques，4卷，2期，121-126(1990)也尝试从发酵肉汤中分离出悬浮的固体，其目的是回收溶解在悬浮培养基中的胞外酶。作者采用了多种不同体系以改进凝胶化或絮凝化。所使用的絮凝剂是冰乙酸、氯化钙、硫酸铝和阳离子聚丙烯酰胺。还采用这些体系，其中两种或多种这些试剂均加入到悬浮培养基中。作者特别描述了这种体系，其中硫酸铝和阳离子聚丙烯酰胺被用作两种絮凝剂。在此示范体系中阳离子聚丙烯酰胺的用量为0.1、0.3和0.5g/l(100、300和500ppm)，而硫酸铝的用量通常为5.0g/l(5000ppm)。尽管采用这种体系得到了发酵肉汤的澄清，但作者声明形成的絮凝物在高剪切条件下会分解为较小的颗粒，这就妨碍了沉积。因此这种体系可以澄清发酵肉汤，但不会提供大块的絮凝物。出于此原因，能够在随后用来从上清液中分离絮凝物的方法受到限制。作者特别建议要用更加温和的离心方法。

欧洲公开专利申请EP-A-448926披露了一种用来使酶絮凝化的体系，细胞材料如细胞和细胞碎片通过机械方法如离心从悬浮培养基如发酵肉汤中除去，而留在上清液中的酶用一种特殊的絮凝剂絮凝化。该絮凝剂是Mannich丙烯酰胺聚合物和二烯丙基二甲基卤化铵聚合物的一种共混物。在所述体系中，必须首先通过机械方法从发酵肉汤中除去细胞材料，因为细胞材料会污染以后的化学沉淀产物。

Weir等人在Biotechnology Techniques，7卷，3期，(1993.3)199-204页中公开了使用壳聚糖从发酵肉汤中使细胞絮凝化的方法，壳聚糖是一种阳离子聚电解质，据报道pH为7.9以上时是中性的。相同的作者还在Biotechnology Techniques，8卷，2期，(1994.2)129-132页中描述了在用壳聚糖作为絮凝剂之前使用各种阴离子聚合物作为预处理剂。

已知在液体培养基中用阳离子聚电解质对微生物细胞进行絮凝化会协助从培养基中分离细胞。当培养基含有高浓度的阴离子聚电解质作为培养基的成分和/或由细胞产生的成分时，加入高分子量阳离子絮凝剂会产生絮凝物。这些絮凝物将会被浓缩的絮凝剂和聚电解质络合物的混合物污染，此络合物由一种阴离子和阳离子聚合物(聚合盐)和/或一种阴离子和阳离子聚合物的沉淀物形成，从而导致絮凝物粘在加工设备上。一种替代的方法是向含有高浓度阴离子聚电解质的细菌培养基中加入低分子量阳离子聚合物絮凝剂，如果要想达到足够的絮凝化，由于形成了阴离子和阳离子聚合物络合物和/或沉淀物，则该方法需要较高的聚合物剂量。此外已经发现使用低分子量阳离子聚合物絮凝剂所产生的絮凝物明显弱于用高分子量聚合物所产生的絮凝物。在剪切作用下细胞从使用低分子量阳离子聚合物絮凝剂所产生的絮凝物中释放出来，并由此导致分离效率的下降。

希望能够提供一种有效的体系以将细胞材料从悬浮培养基如发酵肉汤中分离出来。还希望能够在絮凝化之后使用多种分离方法，并且希望能够提供足以经受各种分离方法的絮凝物块，且如果需要能够提供后续的使用方法。