[发明专利]定向基因去除

说明书

本发明涉及从植物尤其是转基因植物中除去可选择的标志基因或外源辅助核酸的方法，为此的装置及其产物。

发明背景

在植物转化中广泛使用耐受抗菌素或除草剂的重组基因作为选择性标记。一旦按其抗性选择了转基因材料，标志基因就不必要了。在转基因植物中抗菌素或除草剂抗性标记的存在使人担忧耐性品种可能会扩散到野生型植物品种¹或其它品种²。

由于许多原因非常期望能从转基因植物中除去抗性标志基因。相关品种间的异花授粉可能会导致抗性特征传递给种子³，从而危及转基因作物的长期使用并造成潜在的生态问题。例如，编码抗菌素或除草剂抗性的标志可能将转基因植物变成杂草型害物，从而破坏生态平衡。消费者们担忧在食品中广泛使用抗性标志，理论上有可能横向将转基因送递给肠道细菌的危险。如果理论上的危险成为现实，则标志基因可能转化入微生物并增加人和/或动物肠中抗性病原微生物的数量。

期望从转基因植物中除去抗性标志基因的另一个原因是，由于能用于植物转化的标志基因的选择数量有限，通过不同转基因品系的杂交多种转基因特征的组合经常使植物产生含有连接于不同效应基因的相同选择标志的许多拷贝。由于转基因中特定标志基因的存在排除了该标志在随后组合中的使用，这就使得每次组合都需要使用不同的选择标志系统。因此从长远观点来看，可能会需要引入比涉及可获得的合适的可检测标志数量更多的转基因。另一问题是植物中存在的多个同源序列将增加同源-依赖性基因的抑制⁴，这将严重限制转基因作物的可靠的长期使用。

由如上给出的需要从转基因植物除去抗性标志的原因，已开发了许多系统来确保除去可选择的标志基因。例如，两种不同构成物的共转化可以得到整合有这两种转基因的转基因品系⁵，但这种方法的应用是有限的，因为其取决于这两种转基因插入不同基因组区域的效率(这是将它们在遗传杂交中分开所需要的)。另外，这种方法的另一缺陷是由于需要遗传杂交所以费时费力。

作为共转化的替代，用一些转座因子系统和位点特异性重组系统来除去标志⁶。这些系统需要介导重组或转座靶序列间所包括区域缺失的转座酶或重组酶的表达，随后通过基因分离除去此辅助基因，这使得这些系统相对比较耗时。另外，删去的片段还可再插入其它基因组位置，且重组酶或转座酶蛋白质有可能会造成不良的副作用。

另一种除去可选基因标志的方法是基于两个同源序列间染色体内的同源重组(ICR)诱导DNA缺失。虽然通过刺激修复系统能增加ICR，但ICR的固有的缺陷是它的频率太低不足以使该系统有效地应用于产生转基因区域的缺失。例如在烟草中，在6周龄的烟草植物的所有细胞中平均少于10个ICR事件是可以检测到的。

除了上述ICR方法的局限性外，我们还开发了基于λ噬菌体至今未开发区域重组的ICR策略，而且我们能产生惊人的且足够高效率的ICR，从而可以简化缺失转基因标志基因组织的鉴定。

发明概述

本发明一方面提供了一种在转基因整合入基因组后去除转基因部分的方法，包括步骤：将λ噬菌体的附着P区域(attP)置于所述转基因部分的两侧，和诱导染色体内发生各侧翼attP区域之间的同源重组，从而除去位于其间的所述的转基因部分。

本文附着P区域(attP)指包括与高重组效率相关的λ噬菌体DNA区域。

较佳地，所述的转基因的所述部分包括标志基因和/或载体序列和/或其它外源辅助核酸。

较佳地，该基因组是植物基因组。

较佳地，标志基因指针对抗菌素的抗性和/或除草剂的抗性。

可以理解术语标志基因指包括参与特异性生物合成途径的基因和/或参与环境忍耐力的基因。

较佳地，标志基因选自nptII、Ble、dhfr、cat、aphIV、SPT、aacC3、aacC4、bar、EPSP、bxn、psbA、tfdA、DHPS、AK、sul、crsl-1和tdc。

较佳地，该方法能删除两个attP区域间至多10kb的区域，更佳地为7kb的区域。

较佳地，在除去一个以上标志基因和/或载体序列和/或其它辅助核酸时，待删除转基因各不合需要部分的侧翼都有attP区域。因此可以理解本发明的方法可以在相同时间同时除去基因组一个以上不合需要的部分。

较佳地，attP区域含有位于λ噬菌体27492位和27844位间的3052bp。