[发明专利]由衰老体细胞克隆的动物中的端粒恢复和细胞寿命延长

说明书

相关申请书的交叉引用

本申请书是美国系列号09/527,026和09/520,879的部分继续申请，并要求临时申请60/152,340和60/153,233的权利。

发明领域

本发明涉及通过核移植技术复壮衰老、关卡停滞(checkpointarrested)、接近衰老或具有不希望的短细胞寿命的正常或修饰体细胞或细胞DNA的方法。这些方法特别可用于复壮由于复杂遗传操作后的克隆扩充或慢性组织损伤已经达到衰老或接近衰老的细胞，从而提高这些细胞作为供体用于生产克隆转基因动物或用于人类细胞治疗的能力。

本发明也可用于复壮由于逐渐变老或由于与加重的细胞衰老有关的病症(如肌营养不良或动脉粥样硬化、免疫衰老、BPH、神经变性疾病、巴雷特食道硬化、AMD骨关节炎和皮肤溃疡)而衰老或老化的细胞。通过核移植或有关技术可重新编程或恢复患者或动物的细胞，使其再生并恢复为全能性。这些全能细胞可用于生产以下细胞型，包括但不限于：多能性细胞，如间质或前间质干细胞、造血细胞、血管细胞等，它们能移植到患者或动物或合适的供体中。这些细胞将在患者或动物组织中“播种”多种类型的健康可增殖细胞，包括骨、血液、肌肉、神经元、免疫细胞和其它类型。

本发明的方法也包括由复壮的细胞和畸胎瘤产生分化的细胞，该畸胎瘤含有来自任一个或全部三个胚层的细胞，并可用于制备与目的原代细胞有相同基因型的不同类型的原代细胞。这些新产生的原代细胞在组织工程和器官移植治疗领域具有重要意义。也包括再克隆克隆的哺乳动物的方法，特别是与克隆亲代相比，克隆哺乳动物的后代遗传学改变的方法。

本发明也涉及鉴定可调节细胞老化和衰老的化合物和与之相关的基因的试验，特别是可影响端粒长度、EPC-I活性、tPA、胶原酶活性、gas基因、有丝分裂指数和细胞老化和增殖能力的其它指标的化合物。

发明背景

过去十年来的特征在于克隆科学的显著进步，目睹了克隆羊(即“多利”)(Roslin Bio-Med)，被命名为“Mira”的三只克隆山羊(GenzymeTransgenics，利用ACP许可的技术)、几十只克隆牛(ACT)、数代克隆小鼠以及最近的5只克隆猪(PPL)的出生。克隆技术也取得进展，使得现在可以用来自成年、分化细胞的核克隆哺乳动物，科学家们现在知道它们在被导入去核卵母细胞中时经历“重新编程”。参见美国专利5,945,577，在此引用作为参考。

可以用来自成年分化细胞的核产生胚胎细胞或胚胎干细胞这一事实对于器官、细胞和组织移植领域具有重要的意义。例如，可以由取自需要移植的患者的细胞的核产生胚胎干细胞，诱导分化为移植需要的细胞型。利用组织工程领域的技术，能由可用于移植的克隆分化细胞设计组织和器官。因为用于移植的细胞和组织与患者有相同的核基因型，将避免或减少移植物排斥的问题和使用免疫抑制药物所固有的危险。而且，工程细胞和组织可用异源DNA容易地修饰，或修饰使有害基因失活，使得移植的细胞和组织在必要时遗传学相关或改进。与本发明共有并同时申请的美国专利系列号＿＿讨论了遗传修饰供体核DNA和受体线粒体DNA的方法，在此完整引用作为参考。

然而，近来有一些关于克隆细胞的遗传年龄的担心。最近Shiels等人(Nature(1999)399：316)关于克隆羊多利的报道提示，核移植也许不能恢复端粒长度，在由胚、胎及成年细胞克隆的动物中发现的末端限制片段(TRF)大小反映了移植的核的死亡率。这些发现的含义与用于人类移植的置换细胞和组织的克隆特别有关(Lanza等人(1999a)NatureMed.5：975；Lanza等人(1999b)Nature Biotechnol.17：1171)。经历未成熟衰老的移植器官对于体内周围组织将成为破坏性的，实际上能加重置换细胞所要治疗的疾病。Shiels等人的报道也提出了关于核移植产生的细胞是否经历未成熟衰老及核移植产生的克隆动物是否寿命减少的问题。这对高质量家畜的克隆和再克隆又具有严重的影响，而在该报道之前认为克隆优于传统的繁殖技术，后者依赖于在繁殖另一代之前达到交配年龄的动物。