[发明专利]源自微生物的转谷氨酰胺酶的制备方法

说明书

                      发明背景

本发明涉及使用浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)(以下略作S.lividans)的宿主-载体体系，通过基因重组方法分泌生产源自放线菌的转谷氨酰胺酶的方法。通过本发明分泌生产的转谷氨酰胺酶被广泛地应用于食品加工和医药等领域中。

通过本发明分泌生产的转谷氨酰胺酶是催化蛋白质肽链内的γ-羧酰胺基的酰基转移反应的酶。该酶作用于蛋白质时，通过ε-(γ-Glu)-Lys架桥形成反应，引起Gln脱酰胺化后转换为Glu的反应。这种转谷氨酰胺酶可用于果子冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪、或凝胶状化妆品等的制造和改善肉类食品的肉质等(特开平1-50382)。另外，该酶可用于制造热稳定性的微胶囊的材料、固定化酶的载体等，因此是产业上利用率高的酶。

到目前为止，已知有源自动物和微生物的转谷氨酰胺酶(微生物转谷氨酰胺酶：以下略作“MTG”)。前者是依赖于钙离子的酶，分布在动物的脏器、皮肤、血液等，例如豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶(K.Ikuraet al.Biochemistry 27，2898(1988))、人表皮角质细胞转谷氨酰胺酶(M.A.Phillips et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，9333(1990))、人凝血因子XIII(A.Ichinose et al.Biochemistry25，6900(1990))等。

作为源自微生物的转谷氨酰胺酶，例如在链轮丝菌属(Streptoverticillium)细菌中发现的钙非依赖性转谷氨酰胺酶。这样的细菌，例如有灰肉色链轮丝菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)IFO 12776、肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)(以下略作S.cinnamoneum)IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)(以下略作S.mobaraense)IFO 13819等(特开昭64-27471)。肽谱和基因结构解析的结果表明，微生物生成的这些转谷氨酰胺酶的一级结构与源自动物的转谷氨酰胺酶完全没有同源性(欧洲专利公开公报0481504 A1)。

源自微生物的转谷氨酰胺酶(MTG)由于是从上述菌类的培养物经纯化制备的，所以在供给量、效率等方面都存在问题。此外，正在尝试通过基因工程方法来制备转谷氨酰胺酶。关于转谷氨酰胺酶蛋白质及其基因，例如已在特开昭64-27471；Biosci.Biotech.Biochem.，58，82-87(1994)；Biosci.Biotech.Biochem.，58，88-92(1994)，特开平5-199883；Biochimie，80，313-319(1998)；Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)；WO 96/06931、WO 96/22366等文献中报道过。其中，例如有利用浅青紫链霉菌、米曲霉菌(Aspergillusoryzae)、大肠杆菌(Escherichia coli)(以下略作E.coli)等宿主-载体体系表达生产的报道。除此之外，还有在大肠杆菌、酵母等微生物中分泌表达(特开平5-199883)的方法，以及通过大肠杆菌将MTG以非活性融合蛋白质包涵体形式表达后，再用蛋白质变性剂溶解，经去除变性剂使其复性来生产有活性的MTG的方法(特开平6-30771)的报道。然而，按照以往方法由微生物分泌表达时，存在着其表达量非常少的问题。而关于转谷氨酰胺酶在链霉菌中的分泌生产，作为具体分泌蓄积量有记载的例子，虽然有利用浅青紫链霉菌作为宿主，通过基因重组方法导入源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的报道，但其分泌量只有0.1mg/l左右(Biosci.Biotech.Biochem.，58，82-87(1994)，特开平5-199883)。

                       发明公开

本发明的目的在于，提供在链霉菌属细菌中大量分泌生产转谷氨酰胺酶来大量制备转谷氨酰胺酶的方法。