[发明专利]纤维蛋白溶酶原激活剂的反相HPLC分析

说明书

                        发明背景

本发明涉及能定量中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的tPA的测定法，所述tPA出现在CHO细胞中产生的具有天然序列的重组人tPA或其变体的样品中。

                       相关领域描述

组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)是参与导致血凝块解散的一系列事件的内源性丝氨酸蛋白酶(Astrup和Permin，Nature，159，681-682(1947)；Camiolo et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，138，277-280(1971)；Collen，J.Biol.Chem.，33，77-86(1987)；Hoylaerts et al.，J.Biol.Chem.，257，2912-2919(1982))。ACTIVASE^是人类tPA的重组形式(r-tPA)，其用于处理急性心肌梗塞和肺栓塞(Grossbard，Pharm.Res.，4，375-378(1987))。最近ACTIVASE^还获准用于治疗局部缺血性休克(Smith et al.，Acad.Emergency Medicine，6(6)，618-25(1999)；Kwiatkowski et al.，New Enq.J.Med.，340(23)，1781-1787(1999))。这是一种糖蛋白，是通过在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达天然人类tPA的互补DNA(cDNA)而产生的。TNK-tPA是人tPA克隆并表达在CHO细胞中的一种遗传工程变体(Keyt et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA.，91，3670-3674(1994))。所述TNK-tPA变体通过在人类tPA的三个特殊位点进行定点突变而产生。这三个定点突变是Thr103变为Asn(T103N)，Asn 117变为Gln(N117Q)，以及Lys-His-Arg-Arg 296-299变为Ala-Ala-Ala-Ala(KHRR296-299AAAA)。与tPA相比，TNK-tPA具有相似的体外生物学活性，对纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂的抗性增强，对纤维蛋白的特异性增强，且更容易从血浆中清除(Keyt et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA.，91，3670-3674(1994)；Thomas et al.，Stroke，25：10，2072-2079(1994)；Benedict et al.，Circulation，92：10，30323040(1995)；Modi et al.，Thromb Haemost，79，134-139(1998))。r-tPA的单一大药丸给药形式目前正等待批准。CHO细胞合成内源性仓鼠tPA，其称为CHO-PA。经凝血块裂解试验测定，CHO-PA具有类似于人类tPA的纤维蛋白溶解活性。CHO-PA与人类tPA有80％的氨基酸序列同一性。很多取代都是半保守的取代，如：ArgLys，GluAsp，PheTyr，ValAla，IleLeu或ThrSer。利用基于牛胰凝乳蛋白酶结构的人类tPA蛋白酶结构域模型显示，实质上CHO-PA中所有取代均位于或靠近蛋白的表面。