[发明专利]一种转化大粒种子植物的方法及其应用

说明书

本发明的技术领域：

本发明所属的技术领域是农业生物技术领域和植物基因工程领域。

本发明的研究背景：

植物遗传转化(Genetic transformation)或称转化是指把外源核苷酸片段转入植物细胞或组织，使其在受体细胞或再生植株中稳定保留和表达，并通过有性或无性繁殖传递给后代。通过转化，可把控制特定性状的基因转入现有植物品种，打破原有种属的生殖障碍，大大缩短育种周期，创造出常规育种技术很难得到的新型优良品种。

要成功地把外源基因引入某一植物，提高转化频率，就必须找到适合该种植物的最佳转化方法。理想的植物转化方法应具备如下特点：(1)DNA转移效率高；(2)能以相当高的频率再生出可育植株；(3)基因型依赖性小；(4)程序简单、高效、经济、可重复；(5)方便筛选转化细胞或植株；(6)组织培养需要的时间短或不经过组织培养，以减少体细胞无性系变异的发生。

采用常用的转基因技术(农杆菌介导的遗传转化、基因枪轰击法和原生质体为受体的遗传转化)能有效地将外源基因导入植物细胞，但能否从所需的基因型再生大批量的转基因植株则依赖于受体体系。因此，建立能够不受基因型制约的高效转基因受体体系，就是植物基因工程育种领域研究的重要内容。

对植物遗传转化体系的研究已有30多年的历史。1980年代中期，随着多种原生质体培养再生植株的成功，以原生质体为受体的遗传转化工作得到迅速发展。在1980年代后期和1990年代初，用电激法、PEG诱导法等分别获得了多种转基因植株。选用原生质体为受体进行遗传转化，虽具有操作简单、转化率高、转基因植株产生于单细胞克隆和协同转化率高等优点，但由于原生质体再生植株受基因型限制很大，因此很难用生产上所用的基因型为材料，也就因而导致该方法不能被普遍采用。

1985年，Horsch等(Horsch,R.B.等，1985,Science,227:1229-1231)首创由根瘤农杆菌介导的烟草叶盘转化法(1eaf disc transformation)。该方法的意义在于：(1)不必利用原生质体、悬浮培养细胞或愈伤组-织作为基因转移的受体，可以直接用植物组织进行转化；(2)建立了利用天然T-DNA从农杆菌细胞向植物细胞转移目的基因的简便方法。

在此之后，不同植物组织的转化研究相继开展。分别以植物叶片、叶柄、子叶、子叶柄、下胚轴、茎、花茎、匍匐茎、块茎、茎尖分生组织、芽根、块根、合子胚或体细胞胚、甚至成熟种子等作外植体，都已成功获得转化组织或/和植株。由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，农杆菌介导的转化方法曾主要用于双子叶植物(Hawes,M.C.等，1987,Plant Cell Rept.,6:287-290)。但伴随着对T-DNA转移机理的认识，人们近年来在单子叶植物特别是禾谷类作物上做了大量研究，该技术已发展成为禾谷类作物转化的主要技术。

1987年，康乃尔大学的研究者首先设计出一种基因枪，Sanford等(Wang,Y.-C.等,1988,Plant Mol.Biol.,11:433-439)用基因枪法转化洋葱表皮细胞获得成功。这一技术很快被用于禾谷类作物和豆科植物的遗传转化(Wang,YC.等,Plant Mol Biol,11:433-439)，主要受体材料为胚性愈伤组织。从1980年代末到1990年代中期，采用此种方法已在玉米、水稻、小麦及大豆等作物上获得转基因植株，从而使禾谷类作物及难于用农杆菌转化的双子叶植物的遗传转化取得较大突破(Saito等，Europe Patent Application 672752)。

相对于直接转化法来讲，通过农杆菌介导法获得的转基因植株质量和育性都较高，且外源基因整合入受体基因组更为精确(Hansen等，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94:11726-11730)，通常为单拷贝或低拷贝，并基本符合孟德尔遗传定律；转移的DNA片段具有特定末端，基因重排较小；可转移大片段的DNA。因此，农杆菌介导的遗传转化倍受重视。

在对于重要农作物的转化研究中，学者采用了多种方法，试图建立理想的受体体系，但到目前为止，虽然已获得了多种转基因植株，但绝大多数农用品种仍未建立起效率较高的转基因体系。或者说，针对主要农产品植物品种的转化方法仍未得到有效建立。