[发明专利]ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统筛选抗心血管病药的方法

权利要求书

1.一种酶联免疫法(ELISA)，是间接竞争酶联免疫法测定ApoAI：待测抗原ApoAI与过量抗体混合孵育，反应平衡时抗体以抗原-抗体复合物及游离抗体两种形式存在；将此平衡混合物加入预先经抗原包被的酶标板中，混合物中的游离抗体被板上的抗原捕获，抗原-抗体复合物则经洗板除去；最后加入辣根过氧化物酶底物，经显色反应检测板上抗体的浓度，由此可推知待测抗原浓度，

HrpAb₂+Ab+Ag→HrpAb₂-Ab-Ag+HrpAb₂-Ab

                                    ↓进板

           HrpAb₂-Ab-Ag+HrpAb₂-Ab-Ag-Plate

                                    ↓洗板

                      HrpAb₂-Ab-Ag-Plate

                                  ↓底物(OPD)

                           酶标仪492nm检测

HrpAb₂—辣根过氧化物酶标记二抗

Ab     —一抗

Ag     —抗原

Plate  —酶标板。

2.根据权利要求1的酶联免疫法，具体方法如下：

1)抗原包板

ApoAI稀释至200ng/ml，加入酶标板中，每孔50μl，置湿盒中，包板条件为37℃ 2小时或4℃ 16小时，蒸馏水洗板，每孔加入封闭液100μl，室温放置1小时以上，用前再洗板；    

2)孵育

在普通96孔板中，混合一抗，二抗和待测培液或标准：

标准浓度配制：ApoAI等比梯度稀释；

抗体稀释：一抗1∶50000，二抗1∶20000；

空白孔：100μl缓冲液；

最大结合孔：50μl抗体混合液，50μl缓冲液；

标准/样品孔：每孔加入抗体混合液50μl，ApoAI标准或待测培液50μl；

振荡混匀，37℃ 2小时或4℃ 16小时孵育以上；

3)抗体捕获

将96孔板中的孵育液转移至包被好的酶标板中，室温反应30分钟，其间缓缓摇动；

5)检测

以蒸馏水洗板，每孔加入100μl新配制的底物显色液，避光放应30分钟，加入25μl终止液终止反应，与酶标仪波长492nm处测定吸光值。

3.根据权利要求1的酶联免疫法，其中检测后按以下公式分析计算：

(1)标准曲线

标准浓度读数减去空白值后，按以下公式计算： x = ln B / B max 1 - B / B max ]]>

B-标准浓度吸光值  Bmax-最大结合吸光值

y＝lg CONC        CONC  标准浓度(ng/ml)

Y对X作线性回归，回归方程：

y＝-0.478x+1.628(R²＝0.9964)

2)样品浓度计算

样品读数与标准作同样处理，根据以上回归方程计算样品中ApoAI抗原浓度。