[发明专利]ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统筛选抗心血管病药的方法

说明书

本发明涉及细胞靶标筛药系统筛选药物方法，具体涉及ApoAI的ELISA测定方法及ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统筛选第三代升HDL抗动脉粥样硬化心血管病药的方法。

ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统是筛选新一代抗动脉粥样硬化心脑血管病升高密度脂蛋白(HDL)药中的核心技术工具，包括筛药用细胞株的选择，细胞培养系统，ApoAI ELISA测定方法和高通量筛药方法等部分。我们已建立的筛选抗动脉粥样硬化升HDL药系统是根据动脉粥样硬化心脑血管疾病的发病机理，找出并以控制该疾病发生，发展和治疗的关键蛋白ApoAI为靶标，选择以与ApoAI产生和代谢密切有关的细胞株HepG₂为筛选细胞株，建立测定灵敏度高，测定浓度范围大，操作简单，便宜的ApoAI ELISA间接测定法。再以ApoAI ELISA测定法为主体，建立高通量升HDL药筛药方法。通过测定被筛选化合物激发细胞产生ApoAI蛋白的程度来筛选新一代抗动脉粥样硬化升HDL药。

动脉粥样硬化心脑血管疾病(如冠心病，中风)是中国和西方国家致死疾病中的主要杀手。其主要病因是高血清总胆固醇(Gordon et al.1981；Stamleret al.1986；Pooling Project Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病学调查揭示，血清总胆固醇每增加1％，冠心病危险因素增加2％(NCEPR1991)。临床研究发现，降低血清胆固醇水平可以减少冠心病的发病率，阻滞动脉粥样硬化的发展(LPCP 1984；Frick 1987)。胆固醇不溶于水，不能在血液里转运。它们必需与脂蛋白结合才能在血液里运转。人血液里有四种脂蛋白负责胆固醇的运载。它们是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的总胆固醇由LDL运载。LDL携带内源或外源胆固醇，穿过血管壁，进入内皮下(subendothelium)。在内皮下，LDL胆固醇被氧化成氧化型LDL胆固醇，并通过清道夫受体被巨噬细胞以胆固醇酯的形式在细胞内积聚。大量胆固醇酯积聚在巨噬细胞内形成了泡沫细胞。积聚了大量胆固醇酯的泡沫细胞沉积在血管内皮下，形成了动脉粥样硬化斑块核心。资料表明，由LDL运载的胆固醇是导致动脉粥样硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL胆固醇被称为坏胆固醇。胆固醇引起的动脉粥样硬化不但是冠心病的主要根源，同时也是脑血管疾病，如脑血栓形成，中风的重要病因。此外人脑细胞内积聚的高胆固醇酯还可能和老年性痴呆症的形成有关。体内胆固醇来源有内源和外源。外源胆固醇来自于饮食，内源胆固醇是自体合成的结果。内源胆固醇合成亢进和家族性高胆固醇血症在西方国家较为普遍。这种疾病必须通过药物控制。在美国，40％以上的成年人的LDL胆固醇(坏胆固醇)含量超过正常水平。由于胆固醇在形成心脑血管疾病中的重要作用，近十多年来，美国及欧洲药厂都把其抗动脉粥样硬化药的研究和开发放到降低血清总胆固醇及LDL胆固醇上。这些药中疗效最显著的有Merck药厂的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。这些药的作用机理都是抑制人体胆固醇合成的关键酶HMG-CoA-还原酶。虽然HMG-CoA-还原酶抑制药能显著的降低血清总胆固醇，防止、阻止及降低动脉粥样硬化和冠心病发病，发展和死亡，但它只能减少内源性胆固醇合成及降低家族性高胆固醇血症引起的冠心病的发展或恶化。对于治疗外源性胆固醇增多引起的动脉粥样硬化，对于消除已进入巨噬细胞内的胆固醇和抑制由此导致的动脉粥样硬化形成，对于去除动脉粥样硬化斑块中积聚的胆固醇，使动脉粥样硬化血管回复正常，则作用不大或无能为力。换句话说，目前欧美市场流行的抑制内源性胆固醇生成药物不能从根本上治疗广义的动脉粥样硬化心脑血管疾病。