[发明专利]环状单链三特异抗体

说明书

本发明涉及一种基因工程环状单链三特异抗体，编码这种抗体的DNA序列，含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞。

三特异抗体的构建基于在同一个分子上引进三个不同的抗原结合部位。构建时所选用的抗体基因不同，从而产生不同的生物学功能。已报道的三特异抗体的构建主要采用化学嵌合方法，杂交瘤细胞进一步杂交或通过融合基因表达而制得；其中各抗体大都采用抗体Fab片段或在三个抗体中只有一个抗体采用单链抗体小片段(Fay TN，et al.，1988；Tutt A，et al.，1991；Jung G，et al.，1991；Schott ME，et al.，1993；French RR，1998；Somasundaram C，et al，1999；Schoonjans R，et al.，2000a；Schoonjans R，etal.，2000b；Wong WM，et al.，2000)。

本发明的环状单链三特异抗体的构建是基于在肿瘤免疫治疗中起主要作用的T细胞需要双重信号激活而设计的一种新型工程抗体。在肿瘤的免疫治疗中，以T细胞为主的细胞免疫起主要作用。T细胞的激活需要双重信号，第一信号由TCR-CD3复合体提供，与抗原特异性相关；第二信号为APC表面的多个辅助刺激分子提供的共刺激信号。CD3由5种不同的肽链构成，CD3与TCR呈非共价键结合，形成完整的TCR-CD3复合物，共同参与对抗原刺激的免疫应答。如果只有第一信号而没有共刺激信号刺激可导致T细胞的无能甚至凋亡。共刺激信号没有抗原特异性，亦不受MHC限制，但可介导细胞因子分泌，T细胞增殖及效应功能的发挥。CD28是T细胞最主要的一个共刺激信号接受体，在T细胞共刺激信号受体中如CD2，CD4，CD8等，只有CD28可以阻止诱导T细胞产生无能(Slavik et al.1999)。根据这些特点，可以利用抗CD3抗体和抗CD28抗体分别作为它们的配体而起激活T细胞的作用。随着抗体工程技术的不断发展，尤其是基因工程技术在抗体改造上的应用，使得人们可以根据需要对抗体进行改造以更利于应用。目前，已根据抗体的靶向性，构建了既针对肿瘤细胞又可以激活效应细胞的双特异抗体，双特异单链抗体等。

采用基因工程制备的抗体在肿瘤免疫治疗研究报道中，基于抗肿瘤相关抗原抗体(TAA)与抗CD3抗体或抗CD28抗体构成的双特异抗体(BsAb)或单克隆抗体(McAb)的研究报道较多。早期BsAb用于肿瘤免疫治疗的临床试验为单独连接触发分子TCR-CD3和TAA，发现效果不佳，可出现活化的T细胞克隆无能和凋亡，后来采用IL-2或丝裂原植物凝聚素(Lectin)作为共刺激因子在体外予刺激活化T细胞的方法取得一定的效果。随着双信号识别理论的确立以及CD28分子的深入研究，发现抗CD28 McAb可以同B7家族一样传递共刺激信号，协同抗CD3/TAA触发T细胞的充分活化。Demanet et al.(1996)用抗CD3/Id BsAb加抗CD28McAb对BCL1淋巴瘤的Balb/C小鼠模型多次注射，可使负荷105个细胞的淋巴瘤消退，其疗效较单独使用BsAb提高了20倍，而BsAb的用量仅为单独使用的1/10。Bohlen et al.(1997)等用抗CD3/CD19 BsAb和抗CD28 McAb介导自体T细胞治疗人类慢性B淋巴细胞白血病的SCID小鼠模型，得到较好的肿瘤抑制效果，且具有预防复发的价值。进一步的研究是将抗CD3和抗CD28 BsAb共同使用以增强肿瘤的特异性，如Renner et al.(1994)将抗CD3/CD30和抗CD28/CD30两种BsAb联合使用，治疗人何杰金氏淋巴瘤的SCID小鼠取得良好效果。Mazzoni etal.(1996)将抗CD3×抗FBP(卵巢癌TAA)和抗CD28×抗FBP两种双特异抗体同时使用，体外杀伤实验表明，双重信号能有效的激活CD8⁺T细胞，对带有FBP的卵巢癌细胞特异地杀伤。Manzke et al.(1999)将CD3×CD19双特异抗体和CD28双价抗体联合使用，在治疗B细胞介导的淋巴细胞癌中，比单独使用CD3×CD19双特异抗体效果明显。BsAb在实体瘤的治疗上也取得明显效果，Grosse-Hovest et al.(1999)发现抗CD3/tumorBsAb在与B16黑瘤细胞共育的肺癌细胞小鼠模型中有明显的治疗作用，抗CD28 BsAb的合用可明显地提高对肿瘤细胞的攻击率，且在静脉注射BsAb治疗过的小鼠中用肿瘤细胞再次攻击，长期存活的数量明显提高，表明BsAb可诱导小鼠产生长期的保护免疫。因此，如果将抗肿瘤相关抗原抗体，抗CD3抗体及抗CD28抗体的基因融合表达，可以在更有效激活效应细胞，提高肿瘤的治愈率的同时，大大简化生产工艺流程，提高生产效率，降低生产成本。然而，如果简单地将这三种抗体串联成线状分子，不利于在体内运输，而且不稳定。为了解决这一问题，本发明用抗体铰链区片段将这一分子环化，构建成环状单链三特异抗体。