[发明专利]抑制端粒酶活性脱氧核酶寡核苷酸结构及用途

说明书

本发明涉及生物工程药物，具体地说涉及抑制入端粒酶的脱氧核酶寡核苷酸药物的制备及用于抑制恶性肿瘤生长的用途。

癌症是威胁人类生命的重大疾病，对癌症的治疗一直是科学界关注的问题。由于目前广泛使用的放疗和化疗等手段不仅缺少对癌细胞良好的特异性杀伤力，而且有较大的毒副作用，在很大程度上使治疗的范围和效果都受到了限制。因此，寻找一种特异性高、毒副作用小的新型癌症治疗药物对癌症的治疗具有重要的现实意义。近来研究表明端粒酶与癌症有着极为密切的关系。端粒是真核细胞染色体末端的DNA序列，其功能是保持染色体的稳定性。端粒DNA的长短和稳定性决定了细胞的寿命，并与细胞的衰老和癌变密切相关。端粒是由端粒酶合成的。研究发现在永生细胞和85％的人恶性肿瘤细胞中均有端粒酶的活性，而在绝大多数正常人体细胞中却没有端粒酶的表达，因而端粒酶就有望成为癌症诊断的标志物和癌症治疗的靶点(Shay J W et al.Curr Opin oncol，1996，8(1)：66-71)。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核蛋白复合体构成的酶，在端粒合成时由自身的RNA组分提供染色体末端端粒合成的模板。其中具有逆转录酶活性的hTRT蛋白亚基的表达是细胞调节端粒酶活性的主要限速步骤(Meyerson S et al.Cell，1997，90：785-788)。由于其结构的特殊性，可以通过针对编码入端粒酶hTRT蛋白质亚基基因结构的反义寡核苷酸抑制端粒酶的活性，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。

反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide，ASON)是指同一个基因的有意义链或由它转录的RNA特异性互补并能杂交的核苷酸寡聚物，是治疗肿瘤和病毒性传染病的潜在新型药物(Stein et al.Science 1993，262(60)：1004-1012)。国内外已尝试采用反义寡核苷酸治疗恶性肿瘤。尤其令人关注的是催化RNA切割反应的脱氧核酶的发现为目前正在兴起的以基因为靶点的反义基因治疗注入了新的活力。脱氧核酶的发现进一步丰富了反义技术。最典型的催化RNA切割反应的“10-23”型脱氧核酶是由Santoro和Joyce在1997年发现的。“10-23”型脱氧核酶寡核苷酸一般由33个核苷酸组成，其中脱氧核酶的催化中心序列有15个核苷酸(GGCTAGCTACAACGA)，在催化中心序列两端为各由9个核苷酸构成的靶RNA结合区，脱氧核酶的切割位点在RNA底物的嘌呤和嘧啶连接点上(图1)。酶动力学研究表明，该酶的kcat/Km可达10⁹M^-1·min^-1以上，与RNase A(10⁸M^-1·min^-1)、发夹型核酶(10⁷M^-1·min^-1)、及锤头型核酶(10⁷M^-1·min^-1)相比，脱氧核酶的催化降解RNA效率最高。而且在正常的细胞pH、温度和离子强度下，DNA对水解破坏的稳定性比蛋白质约高1000倍，比RNA高100,000倍，具有良好的稳定性(Break RR.Catalytic DNA：in training and seekingemployment.Nat.Biotechnol.1999；17：422)。脱氧核酶既具有反义寡核苷酸相对稳定、易于进行化学修饰、相对低廉的生产成本以及不需要构建载体的所有优点，同时又具有核酶(ribozyme)的酶学特性，并克服了核酶易受RNase降解、需要构建载体又不能象反义寡核苷酸那样直接用药的核酶自身的先天不足。因此，做为新一代反义技术，脱氧核酶的研究和应用已成了新药开发中的热门课题。

本发明的目的是根据编码入端粒酶hTRT蛋白质亚基基因序列设计并制备脱氧核酶寡核苷酸，以此可做为抑制表达端粒酶活性的恶性肿瘤细胞生长的癌症治疗药物。