[发明专利]柯萨奇病毒B抗原酶免试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗原ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒用CoxB病毒B1-6混合型单克隆抗体包被，兔抗CoxB1-6病毒抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的CoxB病毒B1-6混合型抗原，试剂盒由下列组成：

预包被反应条    48孔/96孔     酶标记液         1瓶(3ml)

样品稀释液      1瓶(6ml)      阳性对照         1支(200μl)

阴性对照        1支(200l)     20倍浓洗涤液     1瓶(13ml)

显色剂A         1瓶(3ml)      显色剂B          1瓶(3ml)

终止液          1瓶(3ml)

2.一种如权利要求1所述的一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗原ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：一、包被抗体(CoxB病毒1-6混合单克隆抗体)的制备(一)CoxB病毒1-6型的制备(1)CoxB病毒1-6型毒种来源：昆明生物所(2)Hela细胞来源：中科院细胞所(3)细胞传代：①培养剂配制：PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含：

          牛血清10％；

青霉素4万单位

链霉素4万单位

6％NaHCO₃ 4ml

3％谷氨酰胺6ml②胰酶(DT)配制：用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分

            散、消化细胞；③细胞传代：将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观

        察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分

        瓶培养培养3-5天；(4)病毒的感染、培养、收毒和鉴定：①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液  洗一次；②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时；③补充培养液，在37℃培养；④逐日观察细胞：至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒；⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；病毒滴定：用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微

      量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加

     入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病

     毒的TCID50；病毒的鉴定：应用免疫电镜法及应用中和试验方法(微量滴定法)

病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时；然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变；是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(5)抗原的制备、浓缩和纯化：①病毒灭活；②去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片；③初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯；④病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的

                分光光度计进行蛋白含量的测定；(二)CoxB病毒1-6型混合单克隆(Mc)抗体的制备(1)CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；(2)SP2/0骨髓瘤细胞培养准备；(3)细胞融合、筛选、克隆；(4)单克隆鼠抗CoxB1-6型混合抗体IgG鉴定，滴度＞10^-6，特异性   符合要求；二、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG的制备

用已制备、浓缩和纯化好的CoxB病毒1-6型制备兔抗体IgG(1)CoxB病毒1-6型混合后取1mg/ml加等量完全福氏佐剂钵中研   磨乳化；(2)每只兔颈背部多点皮内注射，每两周1次共5-6次；(3)双扩散效价达1∶64以上时采集血清；(4)辛酸法纯化抗血清IgG部分(5)抗血清IgG蛋白定量；三、酶标记抗体制备

用过碘酸钠法把兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(用方阵滴定法测定)；四、兔抗CoxB病毒1-6型抗体IgG浓度测定

采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶1000五、预包被抗体板及试剂盒原料的制备(1)包被

Na₂CO₃     0.6g

Na₂HCO₃    1.58g

重蒸水             500ml

加入适量CoxB病毒1-6混合型Mc抗体，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干；

(2)洗涤

Tris               2.42g

重蒸水             1000ml

加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原；

(3)封闭

蔗糖               100g

羊血清             25ml

0.1MPBS           1000ml

加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃；

(4)阳性对照制备

诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装；

(5)阴性对照的制备

正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装；

(6)酶标记抗体配制

                      30％小牛血清兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP  50％0.15MPBS

                      20％甘油

                                  →稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液

小牛血清          30ml

0.15MPBS          50ml

甘油              20ml

20％Tween-20      2.5ml

调PH至7.2(8)显色剂A

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g

柠檬酸·H₂O       0.5g

3％H₂O₂         200μl

重蒸水             100ml

调PH至5.0(9)显色剂B

EDTA                 17.5mg

柠檬酸.H₂O          0.5g

重蒸水               100ml

加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25μl(10)终止液

浓H₂SO₄            10ml

蒸馏水               80ml(11)20X洗涤液

Tris                 4.84g

重蒸水               100ml(12)CoxB1-6混合抗原检测流程夹心法如下：

①予包板Mc板

②加待测患者血清

③酶标记兔抗CoxB1-6混合病毒抗体IgG

④加显色剂A、B

⑤450nM波长读O.D值

⑥结果判定六、半成品的检定(1)包被板的检定：CV(％)＜10％(n-10)(2)稳定性检定：①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定

试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置12个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内；②试剂盒37℃稳定性检定

装配前一星期将兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型IgG-HRP检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用；(3)特异性检定：

用62份质控参比血清来检测半成品，阴性参比血清42份允许出现阳性1份，阳性参比血清20份允许出现阴性1份；

阴性质控血清组成：T1-3：HAV抗体阳性血清，T4-6：HCV抗体阳性血清：T7-9：HEV抗体阳性血清，T10-14：HBV表面抗体阳性血清，T15-24：CoxB-IgM阴性血清，T25-27：类风湿因子阳性血清，T28-30：TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39Hopl阳性血清，T40-42抗核抗体阳性血清；42份特异性血清应允许1份为阳性；

阳性质控血清20份组成：Y1-20 CoxB1-6抗原阳性血清，20份阳性血清，应允许1份为CoxB1-6抗原阴性，其余19份应检测为阳性；(4)灵敏度检定①组成：L1#按以下稀释度稀释：1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀：1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀：1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判断标准：L1#灵敏度应检测到1∶64L2#灵敏度应检测到1∶128L3#灵敏度应检测到1∶32(5)精密度测定

将同一样品平行加样10孔，其检测值的变异系数小于15％(CV％＜15)；(6)酶标抗体稀释液，底物液经过37℃细菌培养试验，发现无菌生

长；七、试剂盒组装(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后GMP车间中超净分   装；(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2   支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，   48T/96T；八、成品检定(1)物理检查①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏；②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，  有效期应清楚明晰；③药盒试剂(酶标抗体稀释液，底物液甲，底物液乙，洗涤液)核对  PH值及溶液是否澄清；(2)稳定性检定：完全同半成品检定(3)特异性检定：完全同半成品检定；(4)灵敏度：完全同半成品检定；(5)精密性：完全同半成品检定；(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库；   3个试剂盒   4℃ 2个  隔一个月测定1次   37℃1个  第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记录数据，绘制图表；

2个试剂盒留库备查九、保存与有效期

保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为12个月；