[发明专利]二类内含子靶向整合真核细胞染色体基因组上的特定序列

说明书

本发明属生物技术领域。具体涉及一种二类内含子靶向整合真核细胞染色体基因组上的特定序列的方法。

虽然DNA操作的手段日新月异，但如何使外源DNA序列高效靶向整合到哺乳动物细胞基因组却一直未能得到很好的解决。而如何使外源DNA高效靶向整合不仅是很多理想的基因治疗方案的关键因素，同时也是构建转基因动物等研究的一个瓶颈。虽然说，有一些病毒和一些整合酶可以介导外源DNA的整合，但是这些元件都有着各自的较难克服的缺点。比如说，逆转录病毒虽然能够整合，但只能随机整合，这样就可能引起一些原瘤基因的激活或其它不适当的基因改变，并产生意想不到的表型；再比如说腺相关病毒虽然是目前研究的一大热门，但是很难克服其包装容量小(Dong J.Y.，Human GeneTherapy 19967：2101-2112)、反向末端重复序列(Inverted TerminalRepeat Sequences)为启动子(Haberman R.P.，Jounal of Virology 2000；74(18)：8732-8739)等问题，更不用说，它只能定点整合到人类19号染色体中，而不能靶向到其它目的序列中。至于其它一些较常用的整合酶却存在这样的问题：不但在哺乳动物基因组中很难找到靶向整合所需的序列，而且，即使找到了，位点也很固定、整合的效率不高(Thyagarajan，B.，Gene 2000；244：47-54)。因此如何找到一个高效靶向整合的元件是一个亟待解决的问题。无疑，具有自身剪接和靶向复位(retrohoming)性质的二类内含子(group II intron)(US Patent6,027,895；Guo，H.，Science 2000；289：452-457)的研究结果令人们看到了新的希望。

最近，美国得克萨斯大学奥斯丁分校(University of Texas atAustin)的Lambowitz.Alan等人的研究表明：一些二类内含子(如Ll.ltrB)可以介导外源DNA高效整合到细菌双链DNA，单链DNA或单链RNA中及真菌和一些人体细胞的外源的质粒DNA中(USPatent 6,027,895；Guo，H.，Science 2000；289：452-457)，但是并未证明二类内含子可以介导外源DNA高效整合到真核细胞染色体基因组，这可能与真核细胞染色体位于细胞核内，以及染色体的结构有关。如果想使二类内含子介导外源DNA序列靶向整合到真核细胞染色体基因组中，一方面，必须使蛋白质高效表达(如果想使该二类内含子所编码的蛋白质在胞内直接表达的话)，另一方面必须使该蛋白质从胞浆到达核内；当然，如何检测其整合效率也是个问题。

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种介导外源DNA靶向整合到真核细胞染色体上特定的DNA序列的方法。

本发明提供了一种二类内含子靶向整合真核细胞染色体基因组上的特定序列的方法。

本发明采用一种核苷酸整合酶，促使DNA靶向整合到真核细胞染色体特定序列的方法。这种核苷酸整合酶是由一种二类内含子RNA和这种二类内含子自身编码的蛋白质组成，这种二类内含子是乳酸乳球菌的二类内含子Ll.ltrB；这种蛋白质是LtrA。

该Ll.ltrB RNA具有能与DNA底物的一链的第一内含子RNA结合序列结合的第一杂交序列，还具有能与DNA底物的一链的第二内含子RNA结合序列结合的第二杂交序列。

蛋白质LtrA能够与底物识别位点上的第一序列元件的至少一个核苷酸结合，该LtrA能与Ll.ltrB RNA结合。这种核苷酸整合酶与底物反应，使核苷酸整合酶切割DNA底物第一链及二类内含子RNA插入切割位点。

本发明构建了一种报道型细胞株，这种细胞株含有与Ll.ltrB同源的序列E1E2，该E1E2序列由上面所说的第一内含子RNA结合序列及第二内含子RNA结合序列组成。为了便于检测整合及整合效率，在E1E2序列的下游插入绿色荧光蛋白EGFP(Enhanced GreenFluorescent Protein)报道基因。这个报道基因缺乏启动子。为了防止上游序列对EGFP表达的影响，在E1E2序列上游插入了绝缘子。

上述所说的绝缘子和E1E2及EGFP通过逆转录病毒介导整合到细胞株NIH3T3染色体基因组，由此构建了一种报道型细胞株。