[发明专利]一种以短杆菌生物合成胞外型胆固醇氧化酶及其转化产物胆甾－4－烯－3－酮的方法

权利要求书

1.一种胆固醇氧化酶，其特征为以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82(已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO.M201008)为产酶菌株，酶蛋白分子量为5万道尔顿，全酶含有辅酶FAD，酶活性中心部位有半胱氨酸残基存在。

2.一种发酵法制备胆固醇氧化酶及其分离纯化的方法，其特征为以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82为产酶菌株，以葡萄糖与酵母膏作为最适碳源与氮源，以醋酸铵作为产酶促进剂，以胆固醇作为产酶诱导剂和菌体生长营养因子，发酵生成胆固醇氧化酶，

(1)菌种：

采用从土壤中分离出来的野生型产胆固醇氧化酶短杆菌(Brevibacterium sp.)DGC-007为出发菌株，经紫外(UV)、亚硝基胍(NTG)、UV＋LiCl、DES(烷化剂)、⁶⁰Co诱变处理获得完全胞外型胆固醇氧化酶高产突变株DGCDC-82为产生菌，

(2)发酵工艺

斜面培养基组成(g/100ml)：

牛肉浸膏0.3，NaCl0.5，蛋白胨1，琼脂2，

种子培养基组成(g/100ml)：

牛肉浸膏0.3，NaCl0.5，蛋白胨1，

液体培养基组成(g/100ml)：

胆固醇  0.15～0.5    葡萄糖   2

酵母膏  0.75         NaCl     0.1

醋酸铵  0.2          K₂HPO₄ 0.02

MgSO₄  0.005        FeSO₄   0.001

CaCl₂  0.01         表面活性剂 吐温-80 0.05～0.2

添加剂W 0.15～0.5

培养基PH7.5，1atm灭菌15min，

培养条件：

斜面培养：  30℃，48hr，

种子液培养：30℃，220r/min，12hr，

发酵液培养：摇瓶发酵为250ml三角瓶装液30ml，按10％接种量，30℃，220r/min旋转摇床培养36hr，酶产量高达700U/L，或15L罐发酵为15L自动发酵罐装液6～7L，按5％接种量，33℃，500r/min，通风量1vvm，培养28～32hr，酶产量高达1000U/L以上，

(3)胆固醇添加方式，将胆固醇溶于含表面活性剂和添加剂W的异丙醇溶液，加入水相培养基形成乳状液，可以获得良好的分散效果，以每30ml培养基加1ml胆固醇的异丙醇溶液的比例进行添加，

(4)发酵后期控制发酵液的pH，采用流加NaOH溶液来调节，在发酵30hr时补加NaOH调节pH至7.5左右，

(5)胆固醇氧化酶的分离纯化，表面活性剂TritonX-114双水相系统连续相萃取法，或以盐析、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析连续分离纯化发酵上清液的两种不同方法进行胆固醇氧化酶的分离纯化，纯化后，比酶活达到30U/mg以上。

3.按权利要求2所述胆固醇氧化酶分离纯化的方法，其特征为表面活性剂Triton X-114萃取法分离胆固醇氧化酶，操作条件为：将发酵上清液的pH值调至7.0左右，加入1％(v/v)的表面活性剂Triton X-114，搅拌均匀，在20℃下保温30min，然后在35℃下保温5min，3000r/min离心3min，去除上清液，一次萃取可使酶液体积缩小10倍，酶活回收率为70％。