[发明专利]一种以短杆菌生物合成胞外型胆固醇氧化酶及其转化产物胆甾－4－烯－3－酮的方法

说明书

本发明涉及由自主选育的短杆菌(Brevibacterium sp.)正突变菌株DGCDC-82(已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO.M201008)生物合成胞外型胆固醇氧化酶，胆固醇氧化酶催化胆固醇氧化产生单一的氧化产物胆甾-4-烯-3-酮的方法。并对胆甾-4-烯-3-酮的毒性及降血脂进行研究，表明其在食品和医药等方面的应用。本发明属于微生物酶工程技术领域。

胆固醇是人体内不可缺少的有机组成部分，血液中胆固醇浓度是重要的生理指标，能反映人体的健康状况。而食物中胆固醇含量过高也会对人的健康构成负面影响。正是由于在微生物细胞中发现了胆固醇氧化酶，才有了今天一系列的快速、简便以及自动化的酶法测定胆固醇浓度或含量的方法。随着研究的不断深入，还发现了胆固醇氧化酶的其他作用和功能。自从1948年Turfitt G.E.首次发现灰暗诺卡氏菌产生胆固醇氧化酶以来，已经报导了有多种微生物能产生胆固醇氧化酶。不同微生物产生的胆固醇氧化酶的情况也不一样，有若干不同的特性。经查新，关于胆固醇氧化酶生物合成的研究虽已有公开报导，但多为膜酶类型。除本发明人指导的本课题研究的已发表的文章及学位论文以外，未见有与本发明涉及的技术特点相同的公开文献报导。本发明内容在本发明人及课题组成员已发表的论文的基础上又有新的创造性进展。

本发明的目的是提供一种以短杆菌生物合成胞外型胆固醇氧化酶及其转化产物胆甾-4-烯-3-酮的方法。通过对发酵法生产胆固醇氧化酶以及胆固醇氧化酶性质的研究，为胆固醇氧化酶的开发和应用提供理论指导，以实现工业化生产胆固醇氧化酶及利用该酶转化胆固醇成为胆甾-4-烯-3-酮的新技术。

本发明的内容是

1.一种胆固醇氧化酶，其特征是以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82(已经保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO.M201008)为产酶菌株，酶蛋白分子量为5万道尔顿，全酶含有辅酶FAD，酶活性中心部位有半胱氨酸残基存在。

2.一种发酵法制备胆固醇氧化酶及其分离纯化的方法。以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82为产酶菌株，以葡萄糖与酵母膏作为最适碳源与氮源，以醋酸铵作为产酶促进剂，以胆固醇作为产酶诱导剂和菌体生长营养因子，发酵生成胆固醇氧化酶。

菌种：采用从土壤中自主分离出来的野生型产胆固醇氧化酶短杆菌(Brevibacterium sp.)D6C-007为出发菌株，经紫外(UV)、亚硝基胍(NTG)、UV＋LiCl、DES(烷化剂)、⁶⁰Co诱变处理获得胆固醇氧化酶高产突变株(Brevibacterium sp.)DGCDC-82为产生菌。

发酵工艺：

斜面培养基组成(g/100ml)：

牛肉浸膏0.3， NaCl0.5，蛋白胨1，琼脂2，

种子培养基组成(g/100ml)：

牛肉浸膏0.3， NaCl0.5，蛋白胨1，

液体培养基组成(g/100ml)：

胆固醇  0.15～0.5        葡萄糖 2

酵母膏  0.75             NaCl   0.1

醋酸铵  0.2              K₂HPO₄    0.02

MgSO₄  0.005            FeSO₄ 0.001

CaCl₂  0.01             表面活性剂 吐温-80 0.05～0.2

添加剂W 0.15～0.5

培养基PH7.5，1atm灭菌15min。

培养条件：

斜面培养：30℃，48hr，

种子液培养：30℃，220r/min，12hr，

发酵液培养：摇瓶发酵为250ml三角瓶装液30ml，按10％接种量，30℃，220r/min旋转摇床培养36hr，酶产量高达700U/L：或15L罐发酵为15L自动发酵罐装液6～7L，按5％接种量，33℃，500r/min，通风量1vvm，培养28～32hr，酶产量高达1000U/L以上。

胆固醇添加方式，胆固醇在培养基中是产酶诱导物，也是菌体生长的营养因子。将胆固醇溶于含表面活性剂吐温-80和添加剂W的异丙醇溶液加入水相培养基形成乳状液，能获得良好的分散效果。异丙醇含量过高会抑制菌体生长，以每30ml培养基中加1ml胆固醇的异丙醇溶液的比例进行添加。