[发明专利]使用突变DNA聚合酶的高温逆转录

权利要求书

1.逆转录RNA的方法，包括：

(a)提供含有所述RNA、引物、二价阳离子和突变热活性DNA聚合酶的逆转录反应混合物，其中所述突变DNA聚合酶的特征在于

i)该DNA聚合酶的天然形式中包含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

ii)与天然序列相比，所述氨基酸序列中4位氨基酸突变成除E、A、G或P之外的氨基酸；和

(b)在足以使所述突变DNA聚合酶起始所述引物的延伸产物合成的温度下处理所述反应混合物，以提供与所述RNA互补的cDNA分子。

2.权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

3.权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

4.权利要求3的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

5.权利要求1到4任一项的方法，其中所述二价阳离子是Mg⁺²。

6.权利要求1到4任一项的方法，其中所述突变DNA聚合酶是热稳定性的。

7.权利要求1、3和4任一项的方法，其中所述DNA聚合酶是一种栖热菌DNA聚合酶的突变形式。

8.权利要求7的方法，其中所述DNA聚合酶是嗜热栖热菌DNA聚合酶或水生栖热菌DNA聚合酶的突变形式。

9.权利要求1到8任一项的方法，其中步骤(b)所述反应混合物的温度为40℃到80℃。

10.权利要求1到9任一项的方法，其中与天然序列相比，所述氨基酸序列的4位氨基酸突变成除E、A、G、P、Q或D以外的氨基酸。

11.扩增RNA的方法，包括：

(a)根据权利要求1的方法逆转录所述RNA以提供cDNA；

(b)扩增所述cDNA。

12.权利要求11的方法，其中DNA聚合酶的天然形式包含有选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

13.权利要求11的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

14.权利要求13的方法，其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

15.权利要求11到14任一项的方法，其中步骤(b)中所述扩增是使用聚合酶链反应实现的。

16.权利要求11到15任一项的方法，其中使用单酶逆转录/扩增反应扩增RNA。

17.权利要求11到16任一项的方法，其中所述二价阳离子是Mg⁺²。

18.权利要求11到17任一项的方法，其中所述突变DNA聚合酶是热稳定性的。

19.权利要求11、13和14任一项的方法，其中所述DNA聚合酶是一种栖热菌DNA聚合酶的突变形式。

20.权利要求19的方法，其中所述DNA聚合酶是嗜热栖热菌DNA聚合酶或水生栖热菌DNA聚合酶的突变形式。

21.权利要求11到20任一项的方法，其中步骤(b)所述反应混合物的温度为40℃到80℃。

22.权利要求11到21任一项的方法，其中与天然序列相比，所述氨基酸序列的4位氨基酸突变成除E、A、G、P、Q或D以外的氨基酸。