[发明专利]使用突变DNA聚合酶的高温逆转录

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是逆转录和核糖核酸(RNA)序列扩增的方法。

现有技术状况

术语“逆转录酶”是指一类鉴定为RNA依赖性DNA聚合酶的聚合酶。所有已知的逆转录酶由RNA模板合成DNA均需引物。长期以来，逆转录酶主要用于将mRNA转录成cDNA，后者再被克隆到载体中供进一步操作。

术语“DNA聚合酶”是指一类鉴定为DNA依赖性DNA聚合酶的聚合酶。DNA聚合酶强烈地排斥识别RNA模板，这与其体内功能是一致的。但是，有几个实验室已经发现，某些DNA聚合酶能够在体外转录RNA(Karkas，1973，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70：3834-3838；Gulati et al.，1974，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71：1035-1039；和Wittig和Wittig，1978，Nuc.Acid Res.5：1165-1178)。Gulati等发现大肠杆菌Pol I可用于使用寡聚(dT)10引物转录Qβ病毒RNA。Wittig和Wittig已经证实大肠杆菌Pol I能被用于已使用寡聚(dA)酶促延长的tRNA的逆转录。但是，Gulati等证实，需要的酶量和cDNA产物分子较小的事实表明大肠杆菌Pol I的逆转录酶活性几乎不具实用价值。

水生栖热菌(T.aquaticus，Taq)DNA聚合酶是热稳定性DNA聚合酶，已有报导称使用镁离子作为二价金属离子时其合成cDNA效率很低(Jones and Foulkes，1989，Nuc.Acids.Res.176：8387-8388)。Tse和Forget(1990，Gene 88：293-296)以及Shaffer等(1990，Anal.Biochem.190：292-296)已经介绍了使用Taq DNA聚合酶和镁离子扩增RNA的方法。但是，该方法效果差且不敏感。

RNA和DNA核酸序列扩增的描述可参见美国专利4,683,195；4,683,202和4,965,188，所述专利本文引为参考。优选的方法是聚合酶链反应(PCR)，该方法一般使用Taq DNA聚合酶等热稳定DNA聚合酶进行，这些酶能够经受每个循环中变性扩增产物的温度。在本领域中，PCR现已广为人知，在科学文献中有大量的描述。可参见诸如《PCR应用》1999(Innis et al.，Academic Press，San Diego)，《PCR策略》1995(Innis et al.，Eds.，Academic Press，SanDiego)；《PCR方法》1990(Innis et al.，Eds.，Academic Press，San Diego)；和《PCR技术》1989(Erlich，ed.，Stochton Press，New York)；所述文献均引为参考。PE Biosystems(Foster City，CA)等销售商供应PCR试剂并出版PCR方法。扩增方法的综述见Abramson和Myers，1993，“现代生物技术评析”4：41-47，该文献在此引为参考。

由于使用镁离子缓冲液中的Taq DNA聚合酶的逆转录效率低至不具实用价值，进行由RNA模板起始的PCR扩增时，先使用美拉尼鼠白白血病病毒逆转录酶(MoMuLV RT)或AMV-RT等非热稳定病毒逆转录酶等首先逆转录靶RNA，然后使用热稳定DNA聚合酶扩增所得的cDNA。

一项重要进展是，发现不在镁(Mg²⁺)缓冲液而在锰(Mn²⁺)缓冲液中进行反应时，热稳定DNA聚合酶可以用来有效地逆转录RNA模板，使用DNA模板进行引物延伸更为优选。使用热稳定DNA聚合酶的有效锰离子激活逆转录公开于美国专利5,310,652；5,322,770；5,407,800；5,641,058和5,693,517，所述专利均引为参考。由于由DNA模板的cDNA合成和由DNA模板的DNA合成均可在锰离子缓冲液中进行，使用锰离子缓冲液可以实现单一酶偶联逆转录/扩增反应(也可参见Myers and Sigua，1995，《PCR策略》，同前文，第5章)。

发明概述

本发明提供使用热稳定DNA聚合酶逆转录RNA序列的方法。本发明还提供逆转录和扩增RNA序列的方法，优选在一个偶联的单管反应中使用单一热稳定DNA聚合酶。相对于以前所述的高温逆转录方法，本发明的方法提供了较高的逆转录(“RT”)效率。