[发明专利]定性定量用脱氧核糖核酸标准参照物的制备方法

说明书

本发明是涉及一种广泛应用于分子生物、基因研究的定性定量用脱氧核糖核酸(DNA)标准参照物的制备方法。

DNA标准参照物由一系列大小不同的已知片段所组成。目前有三类商品化的DNA标准参照物。第一类是由酵母基因直接酶解而得到，主要用于几十至几百kb以上的大分子定性。(见参考文献1)第二类DNA标准参照物是通过酶解噬菌体DNA得到一系列大小不等的DNA片段，这些片段之间的差值不同，即从小分子量到大分子量DNA片段以非等差性质增长。(见参考文献2-4)第三类DNA标准参照物是由增长量相同的一系列大小不同的DNA片段组成，或者说其具有等差数列的特征。例如最常使用的1kb DNA标准参照物和100bp DNA标准参照物分别由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10kb和100、200，300，400，500，600，700，800，900，和1000bp片段组成。第三类DNA标准参照物使用起来十分方便，特别适用于临床诊断。DNA标准参照物除应用于分子生物学方面的基础研究外，目前其已愈来愈多的应用于临床诊断，其中包括使用PCR技术进行多态测定和基因分析。

与第二类DNA标准参照物相比较，第三类DNA标准参照物更容易被使用者接受，因而很多制备这类新型DNA标准参照物的方法应运而生。这些方法采用三种不同的方案：1)对PCR产物进行酶解或直接使用PCR产物；(见参考文献5)2)对标准参照物质粒进行酶解；(见参考文献6-8)3)对DNA标准参照物质粒不完全酶解，制备含有多倍数重复的DNA片段的标准参照物。(见参考文献9-11)例如一特定质粒含有一种具有以下特征的插入片段：a)此插入片段含有多个重复的100硷基对的DNA片段；b)这些重复单位彼此相连通过PvuII限制性内切酶位点克隆在载体上。使用PvuII进行不完全酶解产生一系列片段由100bp至1000bp递增的DNA标准参照物。

很显然上述三类DNA标准参照物具有不同的优缺点。前二类DNA标准参照物制备简单可用于定性分析，但用作尺度标准的DNA片段的大小不容易记忆，因片段间不是均匀递增的。并且在一些片段之间存在一段很大的空缺而无法对该区域进行比较准确的尺度定标。第三类DNA标准参照物使用方便但其制备较为复杂。更为严重的问题是其存在着一些技术上的固有缺陷：1)在制备过程中当DNA标准参照物片段不是来自单一的标准参照物质粒时，片段之间不具备确定的比例，缺乏定量功能；2)在制备过程中当DNA标准参照物片段是由不完全酶解法从单一标准参照物质粒产生时，不同片段之间更无法提供确定的比例关系，依然缺乏定量功能；3)当制备过程需要凝胶电泳纯化时，这种制备过程增加了DNA双链分子中产生单链断裂的机会。同时也增加了制造成本；4)一些由不完全酶解产生的DNA标准参照物在凝胶电泳时所形成的带，有时会因为某些带含有不同大小的DNA分子而使带形变宽甚至模糊。

本发明的目的是提供一种可以通过限制性内切酶完全酶解而制备定性定量双功能DNA标准参照物的方法。

根据本发明制备DNA标准参照物的重组DNA设计如下：

a、重组DNA含有一个或多个特定限制性内切酶位点。

b、每一要求长度的DNA片段是由PCR反应制备或直接应用天然基因中可利用的片段，各片段的硷基数目均为一自然数基本定长的整数倍。这些片段通过亚克隆技术形成所需要的重组DNA标准参照物。

c、标准参照物重组DNA的扩增、纯化，并进行限制性内切酶的完全酶解。

在标准参照物重组DNA中一些特定的片段含有多于一个的拷贝数，这一设计有两个优点，一是用以增强某些片段在凝胶电泳时的亮度而便于识别；二是调整大小不同片段的亮度以达到肉眼能同时可见的要求。例如在100bp标准参照物中的100和500bp片段。

下面对本技术方案的内容作进一步的详细描述。