[发明专利]产L－谷氨酸棒状细菌及生产L－谷氨酸的方法

说明书

本申请是申请日为1995年6月7日，申请号为95194559.9，发明名称为“α-酮戊二酸脱氢酶基因”的发明专利申请的分案申请。

                      技术领域

本发明涉及用于L-谷氨酸和L-赖氨酸发酵生产的棒状杆菌的培育和利用。特别地，本发明涉及α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)有缺陷的棒状产L-谷氨酸细菌，一种利用该细菌生产L-谷氨酸的方法，一种编码具有α-KGDH活性的酶并来源于棒状产α-谷氨酸细菌的基因(α-KGDH基因)，含有该基因的重组DNA，携带该重组DNA的棒状杆菌以及一种利用携带该重组DNA并具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌生产L-赖氨酸的方法。

                      背景技术

迄今为止在工业上利用短杆菌或棒状杆菌属的棒状杆菌采用发酵方法生产L-谷氨酸。

最近公开一种大肠杆菌突变株，其中α-KGDH活性缺陷或降低并且谷氨酸分解活性降低，具有高的L-谷氨酸生产能力(日本公开专利：5-244970号)。

相反地，据报道一种短杆菌属的细菌突变株与其母本菌株相比，α-KGDH活性降低，L-谷氨酸生产能力却近似相等(农业生物化学，44，1897(1980)，农业生物化学，46，493(1982))。因此认为α-KGDH活性水平对棒状杆菌中L-谷氨酸的生产并不重要。

另一方面，发现一种短杆菌属的产L-谷氨酸细菌的突变株，其α-KGDH活性降低，将该细菌培养于以过量生物素为碳源且不加入如青霉素及表面活性剂的有抑制生物素效应的物质的培养基中，细菌高效地生产L-谷氨酸(最大产率53％)(日本公开专利6-23779号)。然而，如上述已认为α-KGDH活性水平对棒状杆菌中L-谷氨酸的生产并不重要，却没有已将产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因克隆并分析的例子。并且并未发现α-KGD)H完全缺陷的棒状杆菌突变株。

                   发明内容

本发明的一个目的是得到来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因，制备含有该基因的重组DNA，利用该重组DNA转化的微生物搞清α-KGDH活性对L-谷氨酸发酵生产的影响，并因而提供一种培育产L-谷氨酸棒状杆菌的新方法。具体地，本发明的一个目的是通过破坏染色体DNA上α-KGDH基因得到α-KGDH活性缺陷的产L-谷氨酸棒状杆菌，并提供一种用该细菌生产L-谷氨酸的方法。而且，本发明试图提供一种携带含有α-KGDH基因的重组DNA的棒状杆菌，和一种利用携带该重组DNA并具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌生产L-赖氨酸的方法。

本发明人得到一种来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因，阐明其结构，用已引入该基因的质粒转化一种产L-谷氨酸棒状杆菌，并研究得到的转化体的α-KGDH活性水平与L-谷氨酸生产能力。结果发现α-KGDH活性显著影响L-谷氨酸的生产。而且，本发明人发现一种菌株，其中通过破坏产L-谷氨酸棒状杆菌染色体上α-KGDH基因消除了α-KGDH活性，该菌株培养于含有过量生物素且不加入如表面活性剂和青霉素的任何抑制生物素作用的物质的培养基中，生产并积累相当量的L-谷氨酸。另外，本发明人将含有α-KGDH基因的重组DNA导入具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌。结果发现，得到转化体的L-赖氨酸生产能力显著提高，于是本发明在这些发现的基础上完成。

换句话说，本发明提供：

(1)一种产L-谷氨酸棒状杆菌，它由于染色体上编码具有α-KGDH活性的酶的基因及其启动子的核苷酸序列中一个或几个核苷酸的替换、缺失、插入、加入或倒位而造成α-KGDH活性缺失。

(2)一种生产L-谷氨酸的方法，包括：在液体培养液中培养上述(1)款的产L-谷氨酸棒状杆菌，在培养液中生产并积累L-谷氨酸，再收集。

(3)一种来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因。

(4)通过将来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因与在棒状杆菌中起作用的载体相连接得到的重组DNA。

(5)携带上述(4)款的重组DNA的棒状杆菌。

(6)一种生产L-赖氨酸的方法，包括：在液体培养基中培养携带上述(4)款的重组DNA并具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌，在培养液中生产并积累L-赖氨酸，再收集。

本发明进一步如下详述，