[发明专利]发酵生产核苷酸的方法

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及发酵生产核苷酸的方法。核苷5’-磷酸酯等核苷酸可用作调味品、药物、其原材料等。

相关技术介绍

工业生产核苷5’-磷酸酯的已知方法包括发酵产生核苷，然后使所得核苷酶促磷酸化，以得到核苷5’-磷酸酯。

另一方面，也提出了直接通过发酵生产核苷5’-磷酸酯的方法。例如，日本专利公开(Kokoku)56-12438公开了一种生产5’-鸟苷酸的方法，包括培养一种属于芽孢杆菌属的细菌并收集培养基中产生和积累的GMP，所述细菌为腺嘌呤营养缺陷型，具有对德夸菌素或甲硫氨酸亚砜的抗性，具有生成5’-鸟苷酸(鸟嘌呤5’-单磷酸，也下文也简称为“GMP”)的能力。而且，有数篇关于来自产肌苷的枯草杆菌菌株并产生5’-肌苷酸(肌苷5’-单磷酸，下文也称为“IMP”)的衍生菌株的报导(Magasanik，B.等，生物化学杂志，226，339(1957)；Fujimoto，M.等，农业生物化学，30，605(1966))。但是，直接发酵生产核苷5’-磷酸酯通常效率较低，与上述酶法相比无实用价值。

关于直接发酵生产IMP存在困难的原因，已知的有IMP的细胞通透性差，降解IMP的降解酶广泛存在(核酸发酵，Aminosan KakusanShudankai编，Kodansha Scientific，日本)。为了克服这些障碍，人们已尝试缺失核苷酸降解活性。至于降解IMP成肌苷的降解酶，人们认为有5’-核苷酸酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶等(核酸发酵，上文)。此外，上述日本专利公开56-12438也提出，可以从具有低核苷酸酶活性的突变菌株获得具有高GMP产率的细菌。

至于工业水平生产核苷5’-磷酸酯的技术，已经发展了一种利用产氨短杆菌的突变菌株生产IMP的方法(Furuya et al.，应用微生物学，16，981(1968))。

如上所述，对直接发酵生产核苷5’-磷酸酯已经进行了一些研究，也已知一些成功的实例。但是，关于核苷酸降解酶尚有诸多不明之处，因而，产率的提高尚未被充分研究。具体而言，尚未有以属于埃希氏菌属的细菌实用规模生产核苷5’-磷酸酯的实例。

发明概述

本发明的完成过程中考虑了上述技术现状，本发明的目的是提供使用属于埃希氏菌属的细菌生产IMP等核苷5’-磷酸酯的方法。

发明人为达成上述目的进行了大量研究。结果，发明人发现，大肠杆菌中存在未知的编码5’-核苷酸酶的基因，并成功鉴定了该基因。并且，他们发现，如果新基因和已知的5’-核苷酸酶基因被破坏，具有肌苷或鸟苷生成能力的大肠杆菌可以生产IMP或GMP。至此，完成了本发明。

即，本发明提供：

(1)生产核苷5’-磷酸酯的方法，包括在培养基中培养属于埃希氏菌属、具有产核苷5’-磷酸酯能力的细菌，以在培养基中产生和积累核苷5’-磷酸酯，并由培养基中收集核苷5’-磷酸酯，所述细菌中ushA基因和aphA基因功能异常。

(2)上述(1)中的生产核苷5’-磷酸酯的方法，其中，向ushA或aphA基因中引入突变或破坏该基因以使其功能异常。

(3)上述(1)或(2)的生产核苷5’-磷酸酯的方法，其中，核苷5’-磷酸酯选自5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸。

(4)属于埃希氏菌属、具有生成核苷5’-磷酸酯能力的细菌，其中，ushA和aphA基因被破坏。

(5)上述(4)中的属于埃希氏菌属的细菌，其中，核苷5’-磷酸酯选自肌苷酸或鸟苷酸。

(6)寻找影响核苷5’-磷酸酯积累的5’-核苷酸酶基因的方法，包括在含有第一种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的基本培养基中和含有第二种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的基本培养基中，培养亲本微生物菌株和已知的5’-核苷酸酶缺失的其衍生菌株，以观察亲本菌株和衍生菌株中的基因表达图谱，

计算亲本菌株和衍生菌株培养在含有第一种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的培养基中时各种基因的表达量的比例，和亲本菌株和衍生菌株培养在含有第二种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的培养基中时各种基因的表达量的比例，获得其乘积，选择具有较大乘积值的一个或多个基因。

(7)上述(6)的寻找5’-核苷酸酶基因的方法，其中，第一种核苷5’-磷酸酯为5’-肌苷酸，第二种核苷5’-磷酸酯为鸟苷酸。

(8)上述(6)或(7)的寻找5’-核苷酸酶基因的方法，还包括由选定基因中选择可以编码蛋白转运进入周质所需的信号序列的基因。