[发明专利]诊断试验

说明书

本发明一般涉及基于核酸的试验，该试验可用于检测病毒病原体，特别是乙肝病毒的存在。更特别地，本发明提供了检测乙肝病毒核酸序列的一步扩增试验。本发明的试验可以容易地适应自动化操作，并且可以使待测样品快速流通。本发明还提供了试剂和含有所述试剂的试剂盒，所述试剂可用于进行基于核酸的乙肝病毒检测试验。

说明书的末尾集中列出了说明书中用数字提及的出版物的详细目录。

乙肝病毒(下文称之为“HBV”)可导致使人衰弱的疾病状态，并可导致急性肝衰竭，肝硬化性出血和原发性肝癌。HBV每年感染数百万个体，每年导致至少一百万人死亡。

HBV是DNA病毒，该病毒的复制需借助于RNA中间体，其复制策略利用了逆转录。HBV基因组特性复杂，它具有部分双链DNA结构，所述结构具有重叠的编码多种病毒蛋白的开放阅读框。

尽管可以获得HBV疫苗，但仍有几亿个体是此病毒的携带者。一般通过检测HBV表面抗原(HBsAg)，病毒核心抗原(HBcAg)和抗HBeAg的抗体(抗-HBeAg)来鉴定HBV。

被HBV感染或用HBsAg免疫接种之后，血清出现抗HBsAg的抗体(抗-HBs)。这是免疫检测HBsAg的基础。这种检测系统筛选的是HBsAg或抗-HBs。该试验已被用于：在输血前筛选血液中的HBV，检测急性和慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌患者的HBV-相关肝病，和筛选例如移植受体和供体中的HBV携带者。

HBsAg含有被称为“a”决定簇的抗原区域(1)。“a”决定簇构象复杂，并且依赖于高度保守的半胱氨酸残基之间的二硫键。“a”决定簇中的遗传变异导致产生能逃避由常规疫苗所引起之免疫应答的HBV突变体(2-6)。一个特别常见的突变是HBsAg氨基酸第145位的甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代(G145R)。此突变影响“a”表位区域。

HBV感染的治疗或预防越来越依赖化学和免疫学干预，这导致越来越多地选择出对干预疗法具有抗性的HBV变体。由于HBV重叠的基因组结构，可通过使用化学试剂或疫苗直接或间接选择HBV变体。

因此，常规的基于抗体的HBsAg分析试验可导致假阴性结果。这会对疾病传播的控制和患者管理产生很严重的影响。

在导致本发明的工作中，发明人想寻找另一种HBV测定法。根据本发明，发明人开发出一种一步核酸扩增试验，用于对显示或未显示免疫-可测病毒标记的HBV中的HBV核酸序列进行筛选。本发明基于核酸的分析试验提供了对HBV因子的敏感测定法，尤其当所述HBV因子不能被常规的基于免疫的诊断试验检测时，本发明的试验特别有用。另外，本发明的试验允许根据HBV变体的保守区域开发特异性的免疫球蛋白(如IgG)和疫苗。

纵观本说明书，除非上下文需要，否则术语“含有”应被理解为暗指包括所提及的一个组成要素或整体或一组要素或整体，但不排除任何其它要素或整体或其它组要素或整体。

本发明的一个方面是：提供对样品中HBV-核酸靶序列进行检测的方法，所述方法包括：使样品经受变性条件以产生单链形式的所述靶序列；使该变性样品与一套引物接触，所述引物套含有至少两种引物，其中至少一种引物能与所述靶序列的一条链杂交，其中至少一种其它的引物能与所述第一条链的互补链杂交，其中所述引物能从它们的3’末端延伸，形成与每种所述引物所杂交的链互补的延伸产物；使样品经受有利于扩增的条件，产生含有互补延伸产物的扩增产物；然后检测扩增产物的存在，其中所述扩增产物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在。

本发明的另一方面是：提供对样品中HBV-核酸靶序列进行检测的方法，所述方法包括：使样品经受变性条件以产生单链形式的所述靶序列；使该变性样品与一套引物接触，所述引物套含有至少两种引物，其中至少一种引物能与所述靶序列的一条链杂交，其中至少一种其它的引物能与所述第一条链的互补链杂交，其中所述引物能从它们的3’末端延伸，形成与每种所述引物所杂交的链互补的延伸产物，其中选择与特定区域杂交的引物，所述区域对应于或侧翼于编码HBsAg的完整或部分核苷酸序列内的保守核苷酸序列；使样品经受有利于扩增的条件，产生含有互补延伸产物的扩增产物；然后检测扩增产物的存在，其中所述扩增产物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在。