[发明专利]一种干细胞再生表层角膜及其在角膜移植中的用途

权利要求书

1.一种干细胞再生表层角膜，取胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮，剪碎后用含酶的消化液消化，终止消化后，离心制备单细胞悬液并用于培养；将单细胞悬液置于培养皿或培养瓶中，加入培养基在5％CO₂、37℃条件下培养；当细胞汇聚达80-90％时传代，第2-6代细胞直接传代至经过处理的羊膜上，同样培养条件再非分化培养8-20天后即得到可以作为移植治疗角膜疾病的材料的干细胞再生表层角膜。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，所述的含酶的消化液为胰蛋白酶+EDTA，胰蛋白酶，胶原酶，DispaseI或DispaseII一种或一种以上的组合；优选胰蛋白酶或胰蛋白酶+EDTA

3.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，所述中止消化液采用胎牛血清、DMEM+胎牛血清或hanks液+FBS一种或一种以上的组合；优选胎牛血清，或DMEM+胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，其中所述的培养液包括1∶1-1∶3的DMEM：F12、10％的FBS，10-20ng/ml的EGF。

5.根据权利要求4所述的一种干细胞再生表层角膜，其中所述的培养液进一步还包括：10-30ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF，5-40ug/ml胰岛素，1-10ug/ml转铁蛋白，1-3nM三碘甲状腺原氨酸，谷氨酰胺1-8mM，硒酸钠0-8ug/ml。

6.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，其中所述的羊膜处理采用方法如下：选取择剖腹产产妇所产的、无HIV、乙肝、丙肝及梅毒感染的胎盘，在无菌条件下，用平衡盐液清洗血凝块，钝性分离羊膜，再用含庆大霉素4万U/20ML的平衡盐液清洗羊膜三遍，剪成2.5*2.5CM2大小，上皮基底膜向上贴附于高压灭菌的硝酸纤维素膜上，加入等量DMEM与甘油，-80℃贮存；保存羊膜用于细胞培养时，先在PBS中水化30分钟，再用胰蛋白酶+EDTA，消化3小时，然后用细胞刮刀刮除其上皮，再用PBS洗3遍，上皮基底面向上平铺于培养皿中。

7.根据权利要求6所述的一种干细胞再生表层角膜，所述的制备过程为：取角膜缘上皮，剪碎后用0.1％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化40分钟，等量DMEM+10％胎牛血清终止消化，1200RPM离心10分钟，加入培养基制成单细胞悬液，取1.5ml单细胞悬液移入35MM塑料培养皿中加入培养基在5％CO₂、37℃下培养；

所述的培养基成分：DMEM∶F12＝3∶1，10％胎牛血清，20ng/ml表皮生长因子EGF，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF，胰岛素10ug/ml，10ug/ml转铁蛋白，1nM三碘甲状腺原氨酸，8mM谷氨酰胺；

培养过程：培养细胞每3天换液一次，22天细胞汇聚达80-90％时代，再9天传第2代，再8天传第3代，第三代细胞直接传代至已同上处理的羊膜上，同样培养条件再培养14天后，得到一种用于移植治疗的干细胞再生表层角膜。

8.根据权利要求1-7任一项所述的一种干细胞再生表层角膜，其特征在于羊膜上细胞用BrdU标记24小时后，阳性细胞在15-40％。

9.权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，在眼角膜移植上的应用。