[发明专利]一种干细胞再生表层角膜及其在角膜移植中的用途

说明书

发明领域

本发明涉及一种干细胞再生表层角膜及其在角膜移植上的应用；特别是涉及以胚胎或异体角膜为原料，传代后在羊膜上非分化培养而制成的干细胞再生表层角膜及其在角膜移植上的应用。

背景技术

角膜是眼球最外层的部分，是无血管透明的结构，位于眼球最前端(所谓的黑眼珠)。它像照相机镜头一样是重要的屈光间质，外界光线必须首先通过角膜才能进入眼内。如果因化学性烧伤、热烫伤、感染或其它疾病使角膜变得混浊、角膜表面侵入血管，将严重影响视力，甚至失明。严重的角膜疾病需要通过手术的方法，去除病人混浊部分的角膜，用同样形状的健康透明的角膜来代替病变或损伤的角膜，以达到恢复视力或治疗角膜疾病的目的。

现有技术中角膜移植主要有三种方式，传统角膜移植、自体缘移植和异体缘移植，其主要特点如下：

1.传统角膜移植主要用于治疗各种原因引起的中央角膜混浊，其优点在于术后角膜光学区透明，缺点是仅为中央φ6-7mm光学区移植，对于干细胞缺失者无效，角膜很快再混浊，另外需要长期的免疫抑制治疗。

2.自体缘移植的优点是不需要免疫抑制治疗，但健眼有发生干细胞缺失危险，且不能360°环状移植，效果受到一定的限制。

3.异体缘移植是目前比较成熟的治疗干细胞缺失的手术方法，但供体材料极为有限，治疗机会非常少；有免疫排斥，术后用药至少一年，费用很高。

随着干细胞技术的发展，近年来，人们提出了采用培养干细胞角膜进行移植的方法，如CORNEA 2000；19(4)：421-42中公开了Schwab IR等的采用生物工程组织代替病变角膜的方法，其中角膜皮膜的细胞培养是采用自体或亲属的角膜皮膜，以保存人羊膜(HAM)为载体，传代后在HAM上分化培养细胞，滋养细胞为3T3，采用KGM培养基，无血清培养。这种方法的缺点是虽然在3T3滋养细胞上培养细胞可大量增殖，但因用鼠细胞作滋养细胞而有异源污染危险；另外在羊膜上分化培养使干细胞数量减少，无法保证长期有效性。

N ENGL J MED 2000；43：86-93中，Tsai RJF等人公开了通过移植自体的皮膜重建受损的角膜的方法，其中角膜皮膜的细胞培养是采用自体角膜细胞，以保存人羊膜(HAM)为载体，在HAM上组织块原代培养，培养基为DMEM∶F12＝1∶1，0.5％DMSO，鼠EGF，牛胰岛素，霍乱毒素，5％FBS。这种方法的优点在于自体细胞培养，无排斥反应，不采用滋养细胞3T3，但存在双眼患者不适用且原代培养的培养方法使干细胞与分化细胞混合存在，干细胞数量有限的缺点，可能也无法保证长期有效性。    

发明内容

本发明的目的在于提供一种干细胞再生表层角膜，它几乎由纯的干细胞构成，移植后在体条件下分化，未分化细胞根据自体条件调节，干细胞保持其自我复制能力，可保证移植手术后细胞治疗的长期有效性；免疫排斥轻或无免疫排斥(自体细胞培养移植)，是一种可以用于多种角膜疾病治疗的新型材料。

本发明的再一目的在于上述一种干细胞再生表层角膜在治疗角膜疾病中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：取胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮，将其剪碎后用含酶的消化液消化。终止消化后，离心制备单细胞悬液用于培养；将单细胞悬液置于培养皿或培养瓶中，加入适量培养基培养，培养条件为5％CO₂、37℃。培养细胞每2-3天换液一次；当细胞汇聚达80-90％时传代，将第2-6代细胞直接传代至羊膜上非分化培养，以同样培养条件再培养8-20天后即得到本发明的干细胞再生表层角膜，可以作为移植治疗角膜疾病的材料。

所述的干细胞再生表层角膜植入人体后，于在体条件下分化，未分化细胞根据自体条件调节，干细胞保持其自我复制能力，达到治疗角膜疾病的目的。

其中，本发明所述的成人角膜缘上皮，是指区别于胚胎的成体，可以为几个月的幼儿或任何年龄的成人。

所述的消化液可以是胰蛋白酶+EDTA、胰蛋白酶、胶原酶、DispaseI或DispaseII，以及他们一种或一种以上的组合；优选胰蛋白酶或胰蛋白酶+EDTA；最优选胰蛋白酶+EDTA。

所述的中止消化可以采用胎牛血清、DMEM+胎牛血清或hanks液+FBS，以及他们一种或一种以上的组合来实现；优选采用胎牛血清或DMEM+胎牛血清；最优选采用DMEM+胎牛血清。